Ex Vivo Analyse von mechanisch aktivierten Ca2+ Transienten in Urothelzellen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Bewertung der Funktion von mechanisch aktivierten Ionenkanälen in nativen Urothelzellen unter Verwendung des fluoreszierendenCa2+ -Sensors GCaMP5G.
Abstract
Mechanisch aktivierte Ionenkanäle sind biologische Wandler, die mechanische Reize wie Dehnungs- oder Scherkräfte in elektrische und biochemische Signale umwandeln. Bei Säugetieren sind mechanisch aktivierte Kanäle essentiell für die Erkennung äußerer und innerer Reize in so unterschiedlichen Prozessen wie Berührungsempfindung, Gehör, Regulierung des Volumens roter Blutkörperchen, Basalblutdruckregulierung und Suffizienzgefühl in der Harnblase. Während die Funktion von mechanisch aktivierten Ionenkanälen in der In-vitro-Umgebung mit der Patch-Clamp-Technik ausgiebig untersucht wurde, bleibt die Beurteilung ihrer Funktion in ihrer natürlichen Umgebung eine schwierige Aufgabe, oft aufgrund des begrenzten Zugangs zu den Expressionsstellen dieser Kanäle (z. B. afferente Terminals, Merkel-Zellen, Barorezeptoren und Nierentubuli) oder Schwierigkeiten bei der Anwendung der Patch-Clamp-Technik (z. B. die apikalen Oberflächen von Urothelschirmzellen). Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Bewertung mechanisch evozierter Ca 2+ Transienten unter Verwendung des Fluoreszenzsensors GCaMP5G in einer ex vivo urothelialen Präparation, einer Technik, die leicht für die Untersuchung von mechanisch evozierten Ca2+ –Ereignissen in anderen nativen Gewebepräparaten angepasst werden könnte.
Introduction
Epithelzellen in den Harnwegen sind mechanischen Kräften ausgesetzt, wenn das Harnfiltrat durch die Nephrone wandert, und der Urin wird aus dem Nierenbecken gepumpt und wandert durch die Harnleiter, um in der Harnblase gespeichert zu werden. Es ist seit langem bekannt, dass mechanische Kräfte (z. B. Scherspannung und Dehnung), die von Flüssigkeiten auf die Epithelzellen ausgeübt werden, die die Harnwege auskleiden, die Rückresorption von Protein im proximalen Tubulus und von gelösten Stoffen im distalen Nephronregulieren 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13, sowie die Speicherung von Urin in der Harnblase und Miktion14,15,16,17.
Die Umwandlung mechanischer Reize in elektrische und biochemische Signale, ein Prozess, der als Mechanotransduktion bezeichnet wird, wird durch Proteine vermittelt, die auf die Verformung zellulärer Strukturen oder der zugehörigen extrazellulären Matrix 18,19,20,21 reagieren. Mechanisch aktivierte Ionenkanäle sind einzigartig in dem Sinne, dass sie als Reaktion auf Änderungen der Membranspannung, des Drucks oder der Scherspannung von einem geschlossenen Zustand in einen offenen permeablen Zustand übergehen 18,19,20,21,22. Darüber hinaus könnenCa2+-Transienten durch Integrin-vermittelte Mechanotransduktion oder durch Aktivierung mechanoresponsiver Adhäsionssysteme an den Zell-Zell-Verbindungen23,24,25,26 initiiert werden. Die Funktion des Ionenkanals wird üblicherweise mit der Patch-Clamp-Technik beurteilt, bei der eine Gigaohm-Dichtung zwischen der Zellmembran und der Patchpipette27 gebildet wird. Zellen, die sich in tiefen Gewebeschichten mit einer dichten extrazellulären Matrix (z. B. Nierentubuli) befinden oder von einer physikalischen Barriere (z. B. Glykokalyx) umgeben sind, sind jedoch mit einer Glasmikropipette schwer zugänglich. Ebenso können Zellen, die eingebettete oder integrale Bestandteile von Geweben mit schlechter mechanischer Stabilität sind (z. B. das Urothel), mit der Patch-Clamp-Technik nicht ohne weiteres untersucht werden. Da viele mechanisch aktivierte Ionenkanäle für Ca2+ durchlässig sind, besteht ein alternativer Ansatz darin, ihre Aktivität durch Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung einesCa2+-sensitiven Farbstoffs oder genetisch kodierter Calciumindikatoren (GECIs) wie GCaMP zu bewerten. Jüngste Anstrengungen im Bereich des Protein-Engineerings haben den Dynamikbereich, die Empfindlichkeit und die Reaktion von GECIs28,29,30 signifikant erhöht, und Fortschritte in der Genetik haben ihre Expression in bestimmten Zellpopulationen ermöglicht, was sie ideal für die Untersuchung der Mechanotransduktion geeignet macht.
Das Urothel, das geschichtete Epithel, das das Innere der Harnblase bedeckt, fungiert als Barriere, die die Diffusion von gelösten Stoffen im Urin in das Blaseninterstitium verhindert, fungiert aber auch als Schallkopf, der die Fülle der Blase wahrnimmt und diese Ereignisse an die darunter liegenden Nerven und die Muskulatur weiterleitet16. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Kommunikation zwischen dem Urothel und dem darunter liegenden Gewebe die mechanisch aktivierten Ionenkanäle Piezo1 und Piezo231 erfordert. Um mechanisch induzierte Ca2+-Transienten in Urothelzellen zu bewerten, wurde eine neue Technik entwickelt, die den adenoviralen Gentransfer nutzt, um denCa2+-Sensor GCaMP5G in Urothelzellen zu exprimieren. Diese Technik verwendet eine Schleimhautblattpräparation, die einen einfachen Zugang zur äußersten Schirmzellschicht ermöglicht, und ein computergestütztes System zur gleichzeitigen mechanischen Stimulation einzelner Zellen mit einer geschlossenen Glasmikropipette und zur Aufzeichnung von Fluoreszenzänderungen im Laufe der Zeit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alle Organismen und scheinbar die meisten Zelltypen exprimieren Ionenkanäle, die auf mechanische Reize reagieren 20,33,34,35,36,37. Die Funktion dieser mechanisch aktivierten Kanäle wurde überwiegend mit der Patch-Clamp-Technik untersucht. Aufgrund von Zugänglichkeitsproblemen waren Patch-Clamp-Studien von mechanisch akti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R01DK119183 (an G.A. und M.D.C.) und S10OD028596 (an G.A.) sowie durch die Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores des Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307) unterstützt.
Materials
| 20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
| 4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
| Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
| Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
| cellSens software | Olympus | Imaging software | |
| CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
| Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filter | Chroma | ET470/40X | |
| Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microscope | Olympus | BX51W | |
| Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
| Pipette holder | World Precision Instruments | ||
| Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
| Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
| Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
| Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
| Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
| Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
| Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |
References
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