एक्स वीवो यूरोथेलियल कोशिकाओं में यांत्रिक रूप से सक्रिय सीए2 + ट्रांसिएंट्स का विश्लेषण
Summary
यह प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट सीए 2 + सेंसर जीसीएएमपी 5 जी का उपयोग करके देशी यूरोथेलियल कोशिकाओं में यांत्रिक रूप से सक्रिय आयनचैनलों के कार्य का आकलन करने के लिए एक पद्धति का वर्णन करता है।
Abstract
यांत्रिक रूप से सक्रिय आयन चैनल जैविक ट्रांसड्यूसर हैं जो यांत्रिक उत्तेजनाओं जैसे खिंचाव या कतरनी बलों को विद्युत और जैव रासायनिक संकेतों में परिवर्तित करते हैं। स्तनधारियों में, स्पर्श संवेदना, श्रवण, लाल रक्त कोशिका की मात्रा विनियमन, बेसल रक्तचाप विनियमन और मूत्र मूत्राशय की परिपूर्णता की अनुभूति के रूप में विविध प्रक्रियाओं में बाहरी और आंतरिक उत्तेजनाओं का पता लगाने के लिए यांत्रिक रूप से सक्रिय चैनल आवश्यक हैं। जबकि पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग करके इन विट्रो सेटिंग में यांत्रिक रूप से सक्रिय आयन चैनलों के कार्य का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, उनके मूल वातावरण में उनके कार्य का आकलन करना एक कठिन काम बना हुआ है, अक्सर इन चैनलों की अभिव्यक्ति की साइटों तक सीमित पहुंच के कारण (जैसे, अभिवाही टर्मिनल, मर्केल कोशिकाएं, बैरोसेप्टर्स, और गुर्दे की नलिकाएं) या पैच-क्लैंप तकनीक को लागू करने में कठिनाइयों (जैसे, यूरोथेलियल छाता कोशिकाओं की एपिकल सतहें)। यह प्रोटोकॉल एक पूर्व विवो यूरोथेलियल तैयारी में फ्लोरोसेंट सेंसर जीसीएएमपी 5 जी का उपयोग करके यांत्रिक रूप से उत्पन्न सीए2 + क्षणिकों का आकलन करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है, एक तकनीक जिसे अन्य देशी ऊतक तैयारी में यांत्रिक रूप से उत्पन्न सीए2 + घटनाओं के अध्ययन के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
मूत्र पथ में उपकला कोशिकाओं को यांत्रिक बलों के अधीन किया जाता है क्योंकि मूत्र निस्पंदन नेफ्रॉन के माध्यम से यात्रा करता है, और मूत्र को गुर्दे की श्रोणि से बाहर पंप किया जाता है और मूत्र मूत्राशय में संग्रहीत होने के लिए मूत्रवाहिनी के माध्यम से यात्रा करता है। यह लंबे समय से मान्यता प्राप्त है कि मूत्र पथ को पंक्तिबद्ध करने वाली उपकला कोशिकाओं पर तरल पदार्थों द्वारा लगाए गए यांत्रिक बल (जैसे, कतरनी तनाव और खिंचाव) समीपस्थ नलिका में प्रोटीन के पुन: अवशोषण और डिस्टल नेफ्रॉन में विलेय 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13, साथ ही मूत्राशय में मूत्र का भंडारण और मूत्राशय 14,15,16,17।
यांत्रिक उत्तेजनाओं का विद्युत और जैव रासायनिक संकेतों में रूपांतरण, एक प्रक्रिया जिसे मेकेनोट्रांसडक्शन कहा जाता है, प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता की जाती है जो सेलुलर संरचनाओं या संबंधित बाह्य मैट्रिक्स 18,19,20,21 के विरूपण का जवाब देती है। यांत्रिक रूप से सक्रिय आयन चैनल इस अर्थ में अद्वितीय हैं कि वे झिल्ली तनाव, दबाव, या कतरनी तनाव 18,19,20,21,22 में परिवर्तन के जवाब में एक बंद अवस्था से खुली पारगम्य अवस्था में संक्रमण करते हैं। इसके अलावा, सीए2 + ट्रांसिएंट्स को इंटीग्रिन-मध्यस्थता मेकानोट्रांसडक्शन या सेल-सेल जंक्शनों23,24,25,26 पर मेकेनोरिस्पॉन्सिव आसंजन सिस्टम के सक्रियण द्वारा शुरू किया जा सकता है। आयन चैनल फ़ंक्शन का मूल्यांकन आमतौर पर पैच-क्लैंप तकनीक के साथ किया जाता है, जिसमें कोशिका झिल्ली और पैच पिपेट 27 के बीच एक गीगाहोम सील का गठन शामिलहोता है। हालांकि, घने बाह्य मैट्रिक्स (जैसे, गुर्दे की नलिकाओं) के साथ गहरी ऊतक परतों में स्थित कोशिकाएं या एक भौतिक बाधा (जैसे, ग्लाइकोकैलिक्स) से घिरी कोशिकाओं को ग्लास माइक्रोपिपेट के साथ एक्सेस करना मुश्किल है। इसी तरह, एम्बेडेड कोशिकाएं या जो खराब यांत्रिक स्थिरता (जैसे, यूरोथेलियम) के साथ ऊतकों के अभिन्न अंग हैं, पैच-क्लैंप तकनीक के साथ आसानी से अध्ययन नहीं किया जा सकता है। क्योंकि कई यांत्रिक रूप से सक्रिय आयन चैनल सीए2 + के लिए पारगम्य हैं, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण सीए2 + संवेदनशील डाई या आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) जैसे जीसीएएमपी का उपयोग करके फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा उनकी गतिविधि का आकलन करना है। प्रोटीन इंजीनियरिंग में हाल के प्रयासों ने जीईसीआई28,29,30 की गतिशील सीमा, संवेदनशीलता और प्रतिक्रिया में काफी वृद्धि की है, और आनुवंशिकी में प्रगति ने विशिष्ट सेल आबादी में उनकी अभिव्यक्ति की अनुमति दी है, जिससे उन्हें मेकेनोट्रांसडक्शन का अध्ययन करने के लिए आदर्श रूप से अनुकूल बनाया गया है।
यूरोथेलियम, स्तरीकृत उपकला जो मूत्राशय के इंटीरियर को कवर करती है, एक बाधा के रूप में कार्य करती है, मूत्राशय इंटरस्टिटियम में मूत्र विलेय के प्रसार को रोकती है, लेकिन एक ट्रांसड्यूसर के रूप में भी कार्य करती है, मूत्राशय की परिपूर्णता को महसूस करती है और इन घटनाओं को अंतर्निहित नसों और मांसपेशियों में संचारितकरती है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि यूरोथेलियम और अंतर्निहित ऊतकों के बीच संचार के लिए यांत्रिक रूप से सक्रिय आयन चैनल पीज़ो 1 और पीज़ो 231 की आवश्यकता होती है। यूरोथेलियल कोशिकाओं में यांत्रिक रूप से प्रेरित सीए2 + क्षणिकों का आकलन करने के लिए, एक नई तकनीक का वर्णन किया गया था जो यूरोथेलियल कोशिकाओं में सीए2 + सेंसर जीसीएएमपी 5 जी को व्यक्त करने के लिए एडेनोवायरल जीन ट्रांसफर का उपयोग करता है। यह तकनीक एक म्यूकोसल शीट तैयार करने का उपयोग करती है जो सबसे बाहरी छाता सेल परत तक आसान पहुंच प्रदान करती है और एक बंद ग्लास माइक्रोपिपेट के साथ व्यक्तिगत कोशिकाओं की एक साथ यांत्रिक उत्तेजना और समय के साथ प्रतिदीप्ति में परिवर्तन की रिकॉर्डिंग के लिए एक कंप्यूटर-सहायता प्राप्त प्रणाली प्रदान करती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सभी जीव, और प्रतीत होता है कि अधिकांश सेल प्रकार, आयन चैनलों को व्यक्त करते हैं जो यांत्रिक उत्तेजनाओं का जवाब देते हैं 20,33,34,35,36,37।</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनआईएच अनुदान R01DK119183 (G.A. और M.D.C. को) और S10OD028596 (G.A.) और पिट्सबर्ग सेंटर फॉर किडनी रिसर्च (P30DK079307) के सेल फिजियोलॉजी और मॉडल ऑर्गेनिज्म किडनी इमेजिंग कोर द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
| 4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
| Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
| Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
| cellSens software | Olympus | Imaging software | |
| CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
| Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filter | Chroma | ET470/40X | |
| Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microscope | Olympus | BX51W | |
| Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
| Pipette holder | World Precision Instruments | ||
| Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
| Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
| Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
| Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
| Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
| Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
| Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |
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