Eks Vivo Analyse av mekanisk aktiverte Ca2+ transienter i urotelceller
Summary
Denne protokollen beskriver en metodikk for å vurdere funksjonen til mekanisk aktiverte ionekanaler i innfødte urotelceller ved bruk av den fluorescerende Ca2+ -sensoren GCaMP5G.
Abstract
Mekanisk aktiverte ionkanaler er biologiske transdusere som konverterer mekaniske stimuli som strekk- eller skjærkrefter til elektriske og biokjemiske signaler. Hos pattedyr er mekanisk aktiverte kanaler avgjørende for påvisning av eksterne og interne stimuli i prosesser så forskjellige som berøringsfølelse, hørsel, regulering av røde blodlegemer, basal blodtrykksregulering og følelsen av urinblærefylde. Mens funksjonen til mekanisk aktiverte ionkanaler har blitt grundig studert in vitro-innstillingen ved hjelp av patch-clamp-teknikken, er det fortsatt en vanskelig oppgave å vurdere deres funksjon i deres opprinnelige miljø, ofte på grunn av begrenset tilgang til ekspresjonsstedene til disse kanalene (f.eks. afferente terminaler, Merkel-celler, baroreceptorer og nyretubuli) eller vanskeligheter med å anvende patch-clamp-teknikken (f.eks. de apikale overflatene til urotelparaplyceller). Denne protokollen beskriver en prosedyre for å vurdere mekanisk fremkalte Ca 2+-transienter ved bruk av fluorescerende sensor GCaMP5G i et ex vivo urotelpreparat, en teknikk som lett kan tilpasses for studier av mekanisk fremkalte Ca2+-hendelser i andre innfødte vevspreparater.
Introduction
Epitelceller i urinveiene blir utsatt for mekaniske krefter når urinfiltratet beveger seg gjennom nefronene, og urinen pumpes ut av nyrebekkenet og beveger seg gjennom urinlederne som skal lagres i urinblæren. Det har lenge vært anerkjent at mekaniske krefter (f.eks. skjærspenning og strekk) som utøves av væsker på epitelcellene som strekker urinveiene, regulerer reabsorpsjonen av protein i proksimale tubuli og av løsemidler i distale nefron 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13, samt lagring av urin i urinblære og vannlating14,15,16,17.
Omdannelsen av mekaniske stimuli til elektriske og biokjemiske signaler, en prosess referert til som mekanotransduksjon, formidles av proteiner som reagerer på deformasjonen av cellulære strukturer eller den tilhørende ekstracellulære matrisen 18,19,20,21. Mekanisk aktiverte ionkanaler er unike i den forstand at de overgår fra en lukket tilstand til en åpen permeabel tilstand som svar på endringer i membranspenning, trykk eller skjærspenning 18,19,20,21,22. I tillegg kan Ca 2+-transienter initieres ved integrinmediert mekanotransduksjon eller ved aktivering av mekanoresponsive adhesjonssystemer ved celle-celle-kryss23,24,25,26. Ionkanalfunksjonen vurderes vanligvis med patch-clamp-teknikken, som innebærer dannelse av en gigaohm-tetning mellom cellemembranen og patchpipetten27. Imidlertid er celler som ligger i dype vevslag med en tett ekstracellulær matriks (f.eks. nyretubuli) eller omgitt av en fysisk barriere (f.eks. Glykokalyx) vanskelig tilgjengelige med en glassmikropipette. På samme måte kan celler som er innebygd eller som er integrerte deler av vev med dårlig mekanisk stabilitet (f.eks. Urotelet) ikke lett studeres med patch-clamp-teknikken. Fordi mange mekanisk aktiverte ionkanaler er gjennomtrengelige for Ca 2+, er en alternativ tilnærming å vurdere deres aktivitet ved fluorescerende mikroskopi ved hjelp av et Ca2+-følsomt fargestoff eller genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECI) som GCaMP. Nylige anstrengelser innen proteinteknikk har betydelig økt det dynamiske området, følsomheten og responsen til GECI28,29,30, og fremskritt innen genetikk har tillatt deres uttrykk i spesifikke cellepopulasjoner, noe som gjør dem ideelle til å studere mekanotransduksjon.
Urotelet, det stratifiserte epitelet som dekker det indre av urinblæren, fungerer som en barriere og forhindrer diffusjon av urinoppløsninger i blæreinterstitium, men fungerer også som transduser, registrerer blærefylde og kommuniserer disse hendelsene til underliggende nerver og muskulatur16. Tidligere studier har vist at kommunikasjonen mellom urotelet og underliggende vev krever de mekanisk aktiverte ionkanalene Piezo1 og Piezo231. For å vurdere mekanisk induserte Ca 2+-transienter i urotelceller, ble det utviklet en ny teknikk beskrevet som bruker adenoviral genoverføring for å uttrykke Ca2+-sensoren GCaMP5G i urotelceller. Denne teknikken benytter et slimhinnearkpreparat som gir enkel tilgang til det ytterste paraplycellelaget og et datamaskinassistert system for samtidig mekanisk stimulering av individuelle celler med en lukket glassmikropipette og registrering av endringer i fluorescens over tid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alle organismer, og tilsynelatende de fleste celletyper, uttrykker ionekanaler som reagerer på mekaniske stimuli 20,33,34,35,36,37. Funksjonen til disse mekanisk aktiverte kanalene har blitt overveiende vurdert med patch-clamp-teknikken. På grunn av tilgjengelighetsproblemer har imidlertid patch-klemmestudier av mekanisk ak…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd R01DK119183 (til GA og MDC) og S10OD028596 (til GA) og av Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores fra Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).
Materials
| 20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
| 4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
| Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
| Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
| cellSens software | Olympus | Imaging software | |
| CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
| Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filter | Chroma | ET470/40X | |
| Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microscope | Olympus | BX51W | |
| Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
| Pipette holder | World Precision Instruments | ||
| Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
| Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
| Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
| Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
| Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
| Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
| Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |
References
- Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat. Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).
- Engbretson, B. G., Stoner, L. C. Flow-dependent potassium secretion by rabbit cortical collecting tubule in vitro. American Journal of Physiology. 253 (5), 896-903 (1987).
- Satlin, L. M., Sheng, S., Woda, C. B., Kleyman, T. R. Epithelial Na(+) channels are regulated by flow. American Journal of Physiology Renal Physiology. 280 (6), 1010-1018 (2001).
- Woda, C. B., et al. Ontogeny of flow-stimulated potassium secretion in rabbit cortical collecting duct: functional and molecular aspects. American Journal of Physiology Renal Physiology. 285 (4), 629-639 (2003).
- Malnic, G., Berliner, R. W., Giebisch, G. Flow dependence of K+ secretion in cortical distal tubules of the rat. American Journal of Physiology. 256 (5), 932-941 (1989).
- Khuri, R. N., Strieder, W. N., Giebisch, G. Effects of flow rate and potassium intake on distal tubular potassium transfer. American Journal of Physiology. 228 (4), 1249-1261 (1975).
- Good, D. W., Wright, F. S. Luminal influences on potassium secretion: sodium concentration and fluid flow rate. American Journal of Physiology. 236 (2), 192-205 (1979).
- Wong, K. R., Berry, C. A., Cogan, M. G. Flow dependence of chloride transport in rat S1 proximal tubules. American Journal of Physiology. 269 (6), 870-875 (1995).
- Garvin, J. L. Glucose absorption by isolated perfused rat proximal straight tubules. American Journal of Physiology. 259 (4), 580-586 (1990).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of renal potassium excretion in the rat. American Journal of Physiology. 206 (4), 674-686 (1964).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of distal tubular potassium and sodium transport in rat nephron. American Journal of Physiology. 211 (3), 529-547 (1966).
- Cabral, P. D., Garvin, J. L. Luminal flow regulates NO and O2(-) along the nephron. American Journal of Physiology. 300 (5), 1047-1053 (2011).
- Raghavan, V., Rbaibi, Y., Pastor-Soler, N. M., Carattino, M. D., Weisz, O. A. Shear stress-dependent regulation of apical endocytosis in renal proximal tubule cells mediated by primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8506-8511 (2014).
- Lewis, S. A., de Moura, J. L. Apical membrane area of rabbit urinary bladder increases by fusion of intracellular vesicles: an electrophysiological study. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 123-136 (1984).
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
- Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
- Khandelwal, P., Abraham, S. N., Apodaca, G. Cell biology and physiology of the uroepithelium. American Journal of Physiology Renal Physiology. 297 (6), 1477-1501 (2009).
- Sachs, F. Stretch-activated ion channels: what are they. Physiology. 25 (1), 50-56 (2010).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Ranade, S. S., Syeda, R., Patapoutian, A. Mechanically activated ion channels. Neuron. 87 (6), 1162-1179 (2015).
- Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. Biophysical principles of ion-channel-mediated mechanosensory transduction. Cell Reports. 29 (1), 1-12 (2019).
- Carattino, M. D., Sheng, S., Kleyman, T. R. Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress. Journal of Biological Chemistry. 279 (6), 4120-4126 (2004).
- Ross, T. D., et al. Integrins in mechanotransduction. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 613-618 (2013).
- Dieterle, M. P., Husari, A., Rolauffs, B., Steinberg, T., Tomakidi, P. Integrins, cadherins and channels in cartilage mechanotransduction: perspectives for future regeneration strategies. Expert Reviews in Molecular Medicine. 23, 14 (2021).
- Huveneers, S., de Rooij, J. Mechanosensitive systems at the cadherin-F-actin interface. Journal of Cell Science. 126, 403-413 (2013).
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Sun, X. R., et al. Fast GCaMPs for improved tracking of neuronal activity. Nature Communications. 4, 2170 (2013).
- Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), 152984 (2021).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. The Journal of Physiology. 597 (6), 1467-1485 (2019).
- Delmas, P., Coste, B. Mechano-gated ion channels in sensory systems. Cell. 155 (2), 278-284 (2013).
- Tavernarakis, N., Driscoll, M. Degenerins. At the core of the metazoan mechanotransducer. Annals of the New York Academy of Sciences. 940 (1), 28-41 (2001).
- Peyronnet, R., Tran, D., Girault, T., Frachisse, J. M. Mechanosensitive channels: feeling tension in a world under pressure. Frontiers in Plant Science. 5, 558 (2014).
- Blount, P., Iscla, I. Life with bacterial mechanosensitive channels, from discovery to physiology to pharmacological target. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (1), 00055 (2020).
- Booth, I. R., Miller, S., Müller, A., Lehtovirta-Morley, L. The evolution of bacterial mechanosensitive channels. Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).
