Ex Vivo Análise de Transientes de Ca2+ Ativados Mecanicamente em Células Uroteliais
Summary
Este protocolo descreve uma metodologia para avaliar a função de canais iônicos ativados mecanicamente em células uroteliais nativas usando o sensor fluorescente Ca2+ GCaMP5G.
Abstract
Canais iônicos ativados mecanicamente são transdutores biológicos que convertem estímulos mecânicos, como forças de estiramento ou cisalhamento, em sinais elétricos e bioquímicos. Em mamíferos, os canais ativados mecanicamente são essenciais para a detecção de estímulos externos e internos em processos tão diversos quanto a sensação de toque, audição, regulação do volume dos glóbulos vermelhos, regulação da pressão arterial basal e sensação de plenitude da bexiga urinária. Embora a função dos canais iônicos ativados mecanicamente tenha sido extensivamente estudada no cenário in vitro usando a técnica patch-pamp, avaliar sua função em seu ambiente nativo continua sendo uma tarefa difícil, muitas vezes devido ao acesso limitado aos locais de expressão desses canais (por exemplo, terminais aferentes, células de Merkel, barorreceptores e túbulos renais) ou dificuldades na aplicação da técnica patch-clamp (por exemplo, as superfícies apicais das células guarda-chuva uroteliais). Este protocolo descreve um procedimento para avaliar transientes de Ca 2+ evocados mecanicamente usando o sensor fluorescente GCaMP5G em uma preparação urotelial ex vivo, uma técnica que poderia ser prontamente adaptada para o estudo de eventos de Ca2+ evocados mecanicamente em outras preparações de tecidos nativos.
Introduction
As células epiteliais do trato urinário são submetidas a forças mecânicas à medida que o filtrado urinário viaja através dos néfrons, e a urina é bombeada para fora da pelve renal e viaja através dos ureteres para ser armazenada na bexiga urinária. Há muito se reconhece que as forças mecânicas (por exemplo, tensão de cisalhamento e estiramento) exercidas por fluidos nas células epiteliais que revestem o trato urinário regulam a reabsorção de proteínas no túbulo proximal e de solutos no néfron distal 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13, bem como o armazenamento de urina na bexiga urinária e micção14,15,16,17.
A conversão de estímulos mecânicos em sinais elétricos e bioquímicos, processo denominado mecanotransdução, é mediada por proteínas que respondem à deformação das estruturas celulares ou da matriz extracelular associada 18,19,20,21. Os canais iônicos ativados mecanicamente são únicos no sentido de que fazem a transição de um estado fechado para um estado permeável aberto em resposta a mudanças na tensão, pressão ou tensão de cisalhamento da membrana 18,19,20,21,22. Além disso, os transientes de Ca 2+ podem ser iniciados por mecanotransdução mediada por integrina ou por ativação de sistemas de adesão mecanorresponsivos em junções célula-célula23,24,25,26. A função do canal iônico é geralmente avaliada com a técnica patch-clamp, que envolve a formação de uma vedação gigaohm entre a membrana celular e a pipetapatch-27. No entanto, células localizadas em camadas profundas de tecido com uma matriz extracelular densa (por exemplo, túbulos renais) ou cercadas por uma barreira física (por exemplo, glicocálice) são de difícil acesso com uma micropipeta de vidro. Da mesma forma, células embutidas ou que são partes integrantes de tecidos com baixa estabilidade mecânica (por exemplo, o urotélio) não podem ser prontamente estudadas com a técnica patch-clamp. Como muitos canais iônicos ativados mecanicamente são permeáveis ao Ca 2+, uma abordagem alternativa é avaliar sua atividade por microscopia fluorescente usando um corante sensível ao Ca2+ ou indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs), como o GCaMP. Esforços recentes em engenharia de proteínas aumentaram significativamente a faixa dinâmica, a sensibilidade e a resposta dos GECIs28,29,30, e os avanços na genética permitiram sua expressão em populações celulares específicas, tornando-as ideais para estudar a mecanotransdução.
O urotélio, epitélio estratificado que recobre o interior da bexiga urinária, funciona como uma barreira, impedindo a difusão de solutos urinários no interstício vesical, mas também funciona como transdutor, sentindo a plenitude vesical e comunicando esses eventos aos nervos e musculatura subjacentes16. Estudos prévios mostraram que a comunicação entre o urotélio e os tecidos subjacentes requer os canais iônicos ativados mecanicamente Piezo1 e Piezo231. Para avaliar transientes de Ca 2+ induzidos mecanicamente em células uroteliais, uma nova técnica descrita que usa transferência de genes adenovirais para expressar o sensor de Ca2+ GCaMP5G em células uroteliais foi desenvolvida. Esta técnica emprega uma preparação de folha mucosa que fornece fácil acesso à camada celular guarda-chuva mais externa e um sistema assistido por computador para a estimulação mecânica simultânea de células individuais com uma micropipeta de vidro fechada e registro de mudanças na fluorescência ao longo do tempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Todos os organismos, e aparentemente a maioria dos tipos celulares, expressam canais iônicos que respondem a estímulos mecânicos 20,33,34,35,36,37. A função desses canais ativados mecanicamente tem sido predominantemente avaliada com a técnica patch-praçad. No entanto, devido a problemas de acessibilidade, os estudos p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelas bolsas do NIH R01DK119183 (para G.A. e MDC) e S10OD028596 (para G.A.) e pelo Cell Physiology and Model Organism Kidney Imaging Cores do Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).
Materials
| 20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
| 4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
| Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
| Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
| cellSens software | Olympus | Imaging software | |
| CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
| Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filter | Chroma | ET470/40X | |
| Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microscope | Olympus | BX51W | |
| Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
| Pipette holder | World Precision Instruments | ||
| Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
| Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
| Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
| Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
| Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
| Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
| Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |
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