Summary
최소 침습 기술과 간단한 실험실 장치는 실험 동물에 대한 수술 손상을 줄이고 해부학적 형태 유지를 허용하여 척수 손상 모델의 재현성을 향상시킵니다. 이 방법은 신뢰할 수있는 결과와 재현 가능한 절차가 질병 배상 메커니즘의 조사를 용이하게하기 때문에 가치가 있습니다.
Abstract
척수 손상(SCI)을 모델링하기 위해 최소 침습적 방법을 사용하면 실험 동물 간의 행동 및 조직학적 차이를 최소화하여 실험의 재현성을 향상시킬 수 있습니다.
이러한 방법은 수술 해부학 적 경로의 명확성과 실험실 장치의 단순성 및 편의성이라는 두 가지 요구 사항을 충족해야합니다. 수술자에게 결정적으로 명확한 해부학적 경로는 최소 침습적 노출을 제공하여 수술 절차 중에 실험 동물에 대한 추가 손상을 방지하고 동물이 실험 중에 일관되고 안정적인 해부학적 형태를 유지할 수 있도록 합니다.
본 연구에서는 T9 수준의 척수를 최소 침습적 방식으로 노출시키고 척추 안정제를 사용하여 마우스의 척추를 안정화 및 고정시키기 위해 작은 동물의 척수 손상에 SCI 동축 플랫폼이라는 새로운 통합 플랫폼을 사용하는 방법을 연구하고, 마지막으로 동축 중력 충격기를 사용하여 마우스의 척수를 컨트리뷰하여 다양한 정도의 T9 척수 손상에 접근합니다. 마지막으로, 조직 학적 결과는 독자를위한 참고 자료로 제공됩니다.
Introduction
외상성 척수 손상 (SCI)은 개인을 심각한 결과에 쉽게 노출시킵니다1; 그럼에도 불구하고 현재 효과적인 치료법은 없습니다 1,2. 동물 타박상 모델은 SCI 3,4를 연구하는 주요 방법 중 하나입니다.
2004 년부터 2014 년까지4 건의 연구 중 289 건 (71 %), 69 건 (16.9 %)에서 쥐를 모델 유기체로 사용했습니다. 실제로, 마우스 실험의 비율은 다른 모델에 비해 장점, 특히 유전자 조절 연구 3,4,5의 큰 잠재력으로 인해 수년에 걸쳐 점차 증가했습니다. 따라서, 모델 일관성에 부여된 매우 중요하기 때문에 마우스를 모델로 사용하여 더 많은 연구를 수행하기 위해서는 더 많은 호환 도구가필요하다6. 이전 연구에서보고 된 일반적인 장치는 기본적으로 Allen의 척수 충격 원리를 기반으로합니다 (예 : 기본 체중 강하 임팩터7,8), 뉴욕 대학교 (NYU) / 다기관 동물 척수 손상 연구 (MASCIS) 임팩터1,9 및 무한 지평선 (IH) 임팩터10,11 . 체중 강하 임팩터와 NYU/MASCIS 임팩터는 대상 척수를 조준하고 다른 높이에서 고정 중량을 떨어뜨려 다른 부상 심각도를 만드는 동일한 원리를 공유합니다. IH 임팩터는 다른 힘에 따라 척수 손상을 생성합니다.
SCI 연구에서 마우스 모델을 편리하게 사용하고 효과적인 치료 방법의 기초를 확립하기 위해 척수 손상 동축 플랫폼 (SCICP)이라고하는 통합 마우스 척수 충격 손상 플랫폼이 개발되었습니다. 플랫폼은 4 가지 주요 구성 요소로 구성됩니다 : (1) 수술 된 마우스에 적합한 위치를 위해 설계된 동물 수술대는 매우 컴팩트하고 위치 제한없이 편의를 제공합니다. (2) 수술 중 척추 주위 근육을 유지하는 양측에 마이크로 견인기; (3) SCI의 절차 전에 척추를 고정시키는 척추 안정제 (2 개의 척추 안정기는 쥐와 같은 더 큰 동물에 대한 수술에 사용 가능); (4) 슬리브, 임팩터 팁, 무게 및 당김 핀. 세 부분은 탈착식 X-Y-Z 암에 조립해야 합니다. 정확한 타겟팅을 위해 임팩터 팁을 척수 표면에 배치하고 X-Y-Z 암을 임팩터 팁과 슬리브 사이의 마크를 사용하여 예상 높이까지 부드럽게 내려갑니다. 임팩터 팁은 시술 전에 큰 중량 압축으로 인한 척수 손상을 방지하기 위해 0.12g 알루미늄 합금으로 만들어졌습니다. 당김 핀은 중량 강하를 준비하기 위해 슬리브 상단의 추를 고정하기 위한 것입니다(그림 1).
이전 연구에서 충격력 분할은 IH 장치의 충격력 데이터에 따라 정의되었으며, 이는 각각 30 Kdyn, 50 Kdyn 및 70 Kdyn 6,10입니다. 연구 과정에서 SCI 모델의 연속 학위는 다양한 연구에서 사용할 수있는 SCICP를 기반으로 확립 된 것으로 입증되었습니다. 따라서 공식적으로 실험을 시작하기 전에 서로 다른 질량의 다양한 무게에 의해 생성 된 충격력을 피크 압력 테스트 장치를 사용하여 테스트했습니다. 그 결과, 3개의 표준화된 대표적인 SCI 마우스 모델을 각각 6,10으로 등급이 매겨진 경증, 중등도 및 중증 그룹을 포함한 3가지 부상 정도를 선택했으며, 경증은 1.3g, 중등도 2.0g, 중증 손상은 2.7g으로 동일한 높이에서 가중치를 해제했습니다.
조작성과 정확성을 보장하는 또 다른 수단으로, 새롭고 최소 침습적 수술 접근법이 보고된다. 정상 마우스의 해부학 연구를 통해 T12-T13의 척추 간 공간을 찾는 새로운 방법이 발견됩니다. 수술 단계에서 척추 위치 확인 방법은 마스터하기 쉽고 정확하여 최소 침습 수술을 위한 정확한 위치 지정을 보장합니다.
바라건대, 이 타박상 손상 기술은 병태생리학 이해, 관리 평가 등을 포함하여 척수 손상에 대한 연구와 이해에 도움이 될 수 있습니다.
Protocol
참고 : 모든 실험은 산동 대학교 Cheeloo College of Medicine의 실험 동물 윤리 및 복지위원회 (승인 번호 : 21L60)의 승인을 받았으며 국립 보건원에서 발행 한 실험실 동물 관리 및 사용 가이드 (NIH 간행물 번호 85-23, 개정 1996)에 따라 수행되었습니다.
1. 척수 손상 동축 플랫폼 및 기계적 테스트의 메커니즘
- 수술대, 척추 안정기 및 임팩터 팁으로 플랫폼을 조립합니다(그림 1).
알림: 중량 강하 또는 슬리브의 먼지가 플랫폼의 정밀도에 영향을 미칠 수 있으므로 중량이 기류에 부딪히는 것을 방지하는 중량 강하 및 배기 슬롯을 깨끗하게 유지하십시오. - 정확한 척수 위치를 확인할 수 있는 팁을 소매에 넣습니다.
- 경증, 중등도 및 중증 그룹에 대해 각각 1.3g, 2.0g 및 2.7g인 실험을 위한 체중 강하의 적절한 질량을 선택합니다.
- 당김 핀을 무게 방울의 구멍에 꽂습니다.
- X-Y-Z 암의 홈에 장착된 당김 핀을 사용하여 무게 강하를 슬리브 상단에 조립하여 위치 지정이 완료되면 무게가 해제되어 임팩터 팁에 부딪혀 결과적으로 척수가 손상되고 척수의 변화가 현미경으로 관찰됩니다.
- 작업자의 편의를 위해 탈착식 0.1mm 정밀 X-Y-Z 암을 조정하여 적절한 작업 공간을 제공합니다(그림 1D, E).
알림: 연구 결과의 일관성을 확인하려면 실험을 시작하기 전에 피크 압력 감지 장치를 사용하여 무게를 슬리브 내부에 떨어 뜨릴 때 발생하는 힘을 측정하십시오. 향후 연구를 위해 확인을 반복 할 필요는 없습니다. - 장치를 켜고 금속 압력 수용체를 팁 아래에 놓고 어댑터를 영점으로 조정하고 당김 핀을 풀고 실제 충격력을 기록합니다.
2. 제9 흉추 (T9)의 위치 및 후궁 절제술
참고: 암컷 C57BL/6J 마우스는 9-10주령의 지난 Pengyue 실험 동물 회사(Jinan, China)로부터 구입하였다.
- 실험을위한 수술 도구 제품군을 오토 클레이브하고 수술 전에 75 % 알코올로 수술대를 멸균하십시오.
- 부상 수술을 위해 마취하기 30 분 전에 진통 (0.05-2.0 mg / kg, SQ)을 위해 부 프레 노르 핀을 주사하십시오. 그런 다음 마우스를 이소 플루 란 (유도 : ~ 3 % -5 %, 유지 : ~ 1.5 % -2 %)으로 마취시킵니다. 동물이 꼬리 또는 발가락 꼬집음의 반사 신경에 의해 완전히 마취되었는지 확인하십시오. 마취가 이루어지면 수술대의 지정된 부분에 마우스를 엎드린 자세로 놓고 각막을 안과 연고로 코팅하십시오 (수술 중 눈이 건조하지 않도록 각막에 안과 연고를 바르십시오).
- 흉요추 위의 전기 면도기로 꼬리에서 주둥이까지 머리카락을 면도하십시오. iodophor로 30 초 동안 원을 그리며 피부를 여러 번 소독 한 다음 75 % 알코올을 멸균하십시오. 멸균 수술 드레이프를 바르고 메스와 칼날로 약 T6에서 T13까지 피부에 약 1.5cm의 세로 절개를합니다.
참고: 늑골 가장자리를 따라 T12-T13 척추 간 공간이 있는 정중선까지 촉진합니다. 주둥이를 1.5cm 절개하고 절개는 T6-T13 척추와 대략 같은 높이입니다.
- 흉요추 위의 전기 면도기로 꼬리에서 주둥이까지 머리카락을 면도하십시오. iodophor로 30 초 동안 원을 그리며 피부를 여러 번 소독 한 다음 75 % 알코올을 멸균하십시오. 멸균 수술 드레이프를 바르고 메스와 칼날로 약 T6에서 T13까지 피부에 약 1.5cm의 세로 절개를합니다.
- 수술 현미경으로 뼈 부분에서 한쪽의 13번째 갈비뼈를 탐색합니다. 늑골 척추 각도의 영역을 가볍게 만진 다음 주둥이를 향해 T12-T13의 척추 간 공간을 찾아 정중선의 가시 돌기를 탐색합니다. T12-T13의 공간에서 쪽까지 T9-T10의 척추 간 공간을 탐색하십시오. (그림 2A, 3A)
- T9의 가시 돌기를 따라 척추 주위 근육을 마이크로 가위로 양쪽의 전방 및 후방 후면 관절로 해부합니다 (그림 3B). 마이크로 견인기로 척추 주위 근육을 수축시키고 마이크로 가위로 얇은 판과 T8-T9 및 T9-T10의 척추 간 공간에서 연조직을 청소하십시오.
- T9 후궁 절제술을 시행하고 미세 수술 겸자로 T9의 가시 돌기를 고정하고 약간 들어 올린 다음 척수 손상을 피하고 척수 손상을 피하고 미세 가위로 얇은 판을 잘라냅니다. 왼쪽에서 반복하면 척수가 노출 될 수 있습니다 (그림 2B, 3C).
- 척추를 고정하기 전에 보편적 인 팔을 풀고 척추 안정기의 미세 모기 집게로 척추 양쪽의 9-10 번째 패싯 관절을 천천히 고정하십시오. 마이크로 모기 집게의 나사를 조이면 척추가 안정화됩니다. 척수를 수평면으로 조정하고 유니버설 암을 조이면 척추가 고정됩니다 (그림 3D).
3. T9 타박상 부상
- T9 수준의 척수가 노출되고 척추가 고정되면 수술 현미경 아래의 슬리브 안쪽 팁으로 척수를 겨냥합니다 (그림 3E).
- 현미경으로 척수와 팁의 관계를 쉽게 관찰 할 수 있고 수술대를 쉽게 돌릴 수 있기 때문에 팁의 표면이 척수의 뒤쪽 및 측면 측면에서 척수와 평행한지 확인하십시오.
- 척수와 평행 한 자연 기준면이므로 후궁 절제술 후 팁이 척수와 접촉하기 전에 팁의 표면이 여분의 층의 양측 경계와 평행한지 확인하십시오.
- T12-T13의 척추 간 공간을 찾은 후 임팩터의 끝이 관찰 창의 표시와 일치하고 지정된 높이 22mm에 도달할 때까지 슬리브를 내립니다. 당김 핀을 당겨 무게를 해제합니다(그룹에 따라 1.3g, 2.0g 또는 2.7g, 각 그룹에는 3마리의 마우스가 포함되고 각 그룹에는 각 시점마다 1마리의 마우스가 있음).
알림: 척수는지면과 평행하고 팁에 수직이어야합니다. 테이블이 매우 컴팩트하기 때문에 미세한 시야를 확보하기 위해 수술대를 이동하십시오. - 타박상이 끝나면 임팩터를 제거하고 작동 현미경으로 SCI의 정도를 관찰하십시오. 온화한 그룹에서는 밝은 붉은 색 변화가 보이는 반면, 중간 그룹에서는 부상 부위가 3-4 초 안에 진한 빨간색을 나타내며 아마도 탁월함이 관찰 될 수 있습니다. 심한 그룹에서는 진한 빨간색 증상이 즉시 나타날 수 있으며 경막에서 명백한 탁월함이 나타나지만 경막은 여전히 일관된 모양입니다 (그림 3F).
- 표면 근막과 피부를 봉합사로 봉합합니다 (폴리 프로필렌 비 흡수성 봉합사, 크기 : 6-0).
- 봉합을 마친 후 수술 부위를 소독하고 완전한 의식이 회복 될 때까지 마우스를 온도 조절 패드에 놓은 다음 마우스를 마우스 케이지에 넣습니다.
4. 동물 관리
- 회복을 위해 동물을 가열 패드에 놓고 양쪽 뒷다리의 움직임을 관찰하십시오.
알림: 수술을받은 동물은 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사로 돌려 보내서는 안됩니다. - 동물들이 음식에 쉽게 닿을 수 있도록 새장 바닥에 고수위를 섭취하십시오. 또는 먹이 테이블이 낮은 케이지를 사용하십시오.
- 중등도 및 중증 부상 그룹이 방광 기능을 회복하기 어렵 기 때문에 수술 후 하루에 두 번 마우스의 방광을 비우십시오. 진통제를 위해 부 프레 노르 핀 (0.05-2.0 mg / kg, SQ) 8-12 시간 / 일을 3 일 동안 주사하십시오.
5. 심경 관류, 염색 및 면역 염색
- 부상 후 1 일, 28 일 및 56 일에 각 그룹의 마우스를 관류로 각각 한 마리씩 희생하십시오.
- 과도한 마취 후 60mL의 인산염 완충 식염수(PBS)와 20mL의 4% 파라포름알데히드(4%-6% 이소플루란)로 마우스를 관류합니다.
- 병변 중심에서 각각 주둥이와 꼬리로 1cm 연장되는 마이크로 가위로 척추를 모으십시오.
- 과도한 근육을 절제하고 5.1.4단계에서 기구가 고정할 수 있도록 부분 갈비뼈가 있는 손상되지 않은 척추 부분을 예약하고 4% 파라포름알데히드에 24시간 동안 담그십시오.
- 고정을 위해 지혈 겸자로 갈비뼈를 고정하고 절제 된 층과 척수 병변 중심의 색 변화에 따라 현미경으로 병변 중심을 정의하십시오.
- 꼬리에서 마이크로 가위로 모든 층과 관절 과정을 절제하십시오.
- 마이크로 가위로 신경 뿌리를 잘라 내고 척수를 꺼냅니다.
- 마이크로 가위로 병변 센터에서 꼬리와 주둥이로 각각 연장되는 척수 0.5cm를 수집합니다.
- 척수를 4 ° C에서 48 시간 동안 30 % 자당에 넣습니다.
- 조직 검사 유형에 따라 동결 후 조직을 6μm 두께의 섹션으로 자릅니다.
- 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 수행합니다.
- 섹션을 실온으로 다시 데우고 6μm 두께의 섹션을 4% 포름알데히드에 약 15분 동안 담근 다음 1x PBS에 1분 동안 4회 담가 잔류 OCT를 제거합니다.
- 헤 마톡 실린으로 섹션을 90 초 동안 염색하고 이중 증류수로 헹굽니다.
- 그런 다음 흐르는 물로 3 분 동안 섹션을 씻으십시오.
- 에오신으로 4분 동안 염색하고 95% 알코올에 30초 동안 두 번 담가 과도한 에오신을 헹굽니다.
- 마지막으로 그라데이션 알코올(95% 알코올 및 50% 알코올 한 번, 연속적으로)로 30초 동안 탈수하고 투명도를 위해 크실렌에 2분 동안 담근다. 그런 다음 시편을 수지 겔로 밀봉합니다(관상 평면 섹션: 그림 4, 시상면 섹션: 그림 5).
- 면역 형광 염색을 수행하십시오.
- 섹션을 실온으로 다시 데우고 6μm 두께의 섹션을 4% 포름알데히드에 약 2분 동안 담근다.
- TBST에서 섹션을 5 분 동안 3 번 씻으십시오.
- 절편을 블로킹 용액 (PBS 중 10 % 염소 정상 혈청)으로 배양하고 1 시간 동안 차단하여 면역 글로불린의 비특이적 결합을 차단합니다.
- 척수 절편을 4°C에서 밤새 배양하여 마우스 항아교세포섬유소 산성 단백질(GFAP, 반응성 성상교세포 마커), 다클론 항체(1:600) 및 토끼 항-NF200 항체(1:2000), 신경섬유 마커인 0.4mL의 차단 용액에 넣습니다.
- 절편을 PBS로 헹구고 염소 항토끼 Alexa 594-접합 IgG(1:1,000) 및 염소 항-마우스 Alexa 488-접합 IgG(1:1,000) 2차 항체가 포함된 차단 용액 0.4mL를 실온에서 1시간 동안 추가합니다.
- 형광 현미경으로 각각 594nm 및 488nm 파장의 자동 파노라마 스캔을 통해 10x로 이미지를 촬영합니다(그림 6).
- 형광 현미경을 켜고 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 형광 채널로 전환하고 위치 지정 키를 사용하여 조직에 3-4 개의 지점을 배치하고 초점을 맞추어 촬영을 완료합니다. 촬영이 끝나면 다른 채널의 이미지를 원하는 형식으로 저장 한 다음 병합 된 이미지를 저장하십시오.
Representative Results
장치의 정밀도를 테스트하기 위해 동일한 높이에서 세 개의 다른 질량의 추를 만드는 힘을 피크 압력 테스트 장치를 사용하여 측정했습니다. 다양한 분동 그룹으로 24 개의 테스트를 수행 한 결과±, 1.3g 분동의 경우 0.323N ± 0.02N, 2.0g 중량의 경우 0.543N±0.15N, 2.7g 중량의 경우 0.723N± 0.26N이 발생했습니다 (그림 7). 이전 연구에서는 타박상 강도를 측정하는 단위로 dyne (dyn) 또는 Kilodyne (Kdyn)을 채택했습니다. 이전 연구와의 더 나은 비교를 위해 뉴턴(N)과 다인/킬로다인 간의 변환이 나열되어 있습니다(1 N = 1 kg × 1 m/s 2 = 1 × 10 3 g × 1 × 100 cm/s2 = 1 × 105 dyn; 0.323 N = 32.3 Kdyn; 0.543 N = 54.3 Kdyn; 0.723 N = 72.3 Kdyn).
표 1 및 도 4 는 관상 절편의 경증, 중등도 및 중증 그룹의 병변 데이터를 보여줍니다. 그림 4에서 볼 때, 손상 후 28 일째에 경증, 중등도 및 중증 그룹에서 구별 가능한 회백질 경계의 연속성이 연속적으로 감소했으며 흉터 조직의 면적이 커지고 병변 중심의 단면에 장착 비율이 증가했습니다. 정상 그룹과 비교하여 모든 실험 그룹에서 명백한 형태학적 차이가 있었습니다. 이것은 실험 그룹에서 부상 학위 분할의 합리성을 입증했습니다.
표 2 와 그림 5 는 시상 절편에서 손상 후 1 일과 56 일에 척수 손상을 설명합니다. 병변의 면적은 부상 후 1일째에 경증에서 중증군으로 점차 유의하게 증가한 것을 볼 수 있다. 한편, 척수 양쪽의 백질의 연속성은 간질 부종의 특징 인 관찰 가능한 작은 둥근 액포와 함께 경증 그룹에서 더 좋았습니다. 중간 그룹에서는 백질이 연속성이 좋지 않았고 복부 백질의 구조가 정렬되지 않았습니다. 심한 그룹에서는 복부 백질이 더 심각한 파괴를 보였고 부상의 중심에 공동의 넓은 영역이 나타났습니다. 또한 주변 조직은 적혈구가 분명히 채워져 있었고 중앙 운하 근처의 적혈구가 스트립으로 모였습니다. 부상 후 56 일째에 세 그룹의 부상 센터에서 흉터 형성이 관찰되었으며, 부상의 중증도에 따라 면적이 증가했습니다.
손상 후 56일째에 척수 신경섬유의 완전성은 또한 면역형광 염색 결과의 분석으로부터 도출될 수 있다(도 6). 이 그림은 또한 세 그룹의 부상 모두에서 겹치는 흉터 형성 성상 세포가 보였으며 부상의 심각성에 따라 부상 부위의 길이가 증가하고 흉터 직경이 감소했음을 보여줍니다. 이것은 척수 직경의 감소로 이어질 수 있는 흉터 구축의 존재를 시사합니다.
그림 1 : 척수 손상 동축 플랫폼의 전체 및 부품 전시회. (A) X-Y-Z 팔과 수술대를 분리할 수 있어 작은 동물의 척수가 노출되는 수술 절차를 위한 충분한 공간을 확보할 수 있습니다. 수술 테이블은 작동 중에 자유롭게 움직일 수 있어 위치 제한으로 인한 잠재적인 작동 어려움을 줄입니다. 척추 안정기의 몸체에는 방향 보조를위한 3 관절 범용 팔이있어 유연성이 향상됩니다. (B) 임팩터 팁을 슬리브에 넣고 후자를 X-Y-Z 암에 조립합니다. 무게가 떨어지지 않도록 당김 핀의 끝을 추의 구멍에 넣고 추를 슬리브에 넣습니다. 부품이 조립된 상태에서 현미경으로 대상 부상 부위를 찾습니다. 그런 다음 임팩터 팁의 끝이 관찰 창의 아래쪽 레벨과 일치할 때까지 X-Y-Z 암을 내립니다., 이는 통합된 타박상 높이에 도달했음을 나타냅니다(추추와 임팩터 팁 사이의 높이는 낙하가 시작될 때 22mm임). 당김 핀을 당기면 충격이 가해집니다. (C) 부상 부위가 노출된 후 클립을 사용하여 마우스의 척추를 고정하고 조임 볼트를 사용하여 척추 안정기를 고정합니다. (D) 수술대의 홈에 권장되는 기능. 실험 동물은 중간 홈에 넣고 머리는 경사면의 앞쪽, 흉부 부분을 향하게합니다. X-Y-Z 암은 수술대에서 분리됩니다. (E) 조립된 SCICP의 디스플레이. 화살표는 부품을 나타냅니다. 팁이 대상 타박상 부위를 겨냥한 상태에서 타박상을 시작하려면 당김 핀을 당기면 무게가 임팩터 팁에 떨어지면 척수를 오염시킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: T13 늑추추추 위치 확인 방법의 이미징 그래프. (A) 13 번째 늑골과 T13은 비교적 일정한 해부학 적 구조입니다. T13 늑추각은 현미경으로 쉽게 감지할 수 있으며, 이를 통해 작업자는 가시돌기를 조사하고 T12-T13 척추간 공간을 찾을 수 있습니다. 그런 다음 쪽을 연속적으로 조사하여 대상 손상 척추(예: T9)를 찾습니다. (B) 최소 침습적 9th 흉부 후궁 절제술은 인접한 척추체 사이의 적절한 층과 후관절을 보존 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 마우스에서 T9 수준 척수의 노출 및 타박상 . (A) T13 늑추각 프로브. (B) 수술을위한 적절한 공간을 만들기 위해 마이크로 견인기에 의해 수축 된 척수 주위 근육으로 T9를 노출시킵니다. (C) 마이크로 가위로 T9 후궁 절제술을 시행합니다. (D) 척추 안정기의 클립으로 척추를 안정화시킵니다. (E) 임팩터 팁으로 대상 타박상 영역을 조준합니다. (F) 타박상 후 부상 부위에 부종과 혼잡이 나타납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 마우스에서 상이한 정도의 SCI 후 28일째의 대표적인 절편(coronal section). (A) 마우스의 정상 흉부 척수. 스케일 바 = 500 μm. (B) 경증 그룹의 경우 척수의 등쪽 측면에서 약간의 손상이 나타날 수 있지만 예비 백질과 회백질의 형태는 실질적으로 보존됩니다. (C) 중등도 그룹의 경우 척수에서 명백한 흉터 조직이 관찰됩니다 (빨간색 별표로 표시). 백질과 회백질의 구별 특성은 거의 구별 할 수 없습니다. (D) 상대적으로 중증 그룹의 척수는 원래 형태를 거의 잃어 버렸고 거의 흉터 조직으로 대체되었습니다. 녹색 점선은 손상 영역을 나타내고 검은 색 점선은 관찰 가능한 회색 물질의 경계를 나타냅니다. 부상의 심각성이 증가함에 따라 마우스의 척수에 더 큰 병변과 덜 절약된 구조가 나타났으며 회백질의 경계는 거의 구별할 수 없었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 마우스의 척수 손상 후 1 일 및 56 일의 대표 절편 (시상 절편). (A) 마우스의 정상 흉부 척수. (B) B1-B3는 각각 경증, 중등도 및 중증군에서 손상 후 1일째의 척수를 나타낸다. 손상이 증가함에 따라 병변 센터에서 더 큰 영역이 중단되거나 액화되었음을 알 수 있습니다. 복부 척수에서 백질의 연속성은 부상 강도가 다르기 때문에 달랐습니다. B1은 복부 척수의 백질이 약간의 부종과 함께 더 나은 연속성을 가지고 있음을 보여줍니다. B2는 복부 척수에서 백질의 연속성이 좋지 않고 부종이 심합니다. B3 SCI의 중심에있는 조직은 거의 모든 연속성을 잃어 버렸고 부상의 중심 바깥 쪽 부위에 광범위한 부종이 있습니다. (C) C1-C3은 경증, 중등도 및 중증 그룹에서 손상 후 56 일째에 척수를 각각 나타냅니다. 다른 그룹 사이의 부상 센터에서 다른 정도의 흉터 구축이 나타 났으며 부상 부위의 직경에는 상당한 차이가있었습니다. 스케일 바 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 마우스의 척수 손상 후 56일째의 대표 절편(시상 절편). (A) 경증 그룹의 대표 섹션. NF200은 신경 섬유를 나타내고 GFAP는 성상 세포를 나타냅니다. 겹치는 성상 세포는 병변 진원지에서 관찰되는 반면, 척수의 복부 부분에있는 신경 섬유는 양호한 연속성을 가지고 있습니다. (B) 온건 그룹의 대표 섹션. 겹치는 성상 세포 외에도 두 개의 흉터 중심 (빨간색 별표로 표시)이 관찰 될 수 있으며 복부 측면의 신경 섬유는 연속성을 갖습니다. (C) 큰 병변 범위와 거대한 흉터 형성 성상 세포를 가진 중증 그룹의 대표 섹션. 명백한 흉터 중심이 관찰되지 않았으며 신경 섬유는 연속성이 좋지 않습니다. 스케일 바 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 같은 높이에서 발생하지만 무게가 다른 힘. 실험 전에 동일한 높이에서 방출 된 다른 질량의 무게에 의해 생성 된 힘을 피크 압력 감지 장치를 사용하여 감지했습니다. 각 그룹이 24개의 검출을 완료한 후, 타격력의 참조를 위해 더 신뢰할 수 있는 중력 데이터가 얻어졌다. 데이터는 통계 소프트웨어 SPSS19.0을 사용하여 분석되었습니다. 데이터는 각 군에서 평균 ± SD, n=24로 제시된다. 더 많은 그룹 간의 비교는 차이를 테스트하는 데 사용 된 일원 분산 분석 (ANOVA)을 기반으로했습니다. p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 28 도트 퍼 인치 | |||
| 그룹 | GMR (%) | WMR (%) | DR (%) |
| 보통 | 35.44 | 64.57 | 0 |
| 심하지 않음 | 11.59 | 64.88 | 23.53 |
| 온화한 | 0 | 41.14 | 58.86 |
| 아주 심함 | 0 | 0 | 100 |
표 1: 부상 후 28일째의 백질, 회백질 및 손상 비율. 약어 : dpi = 부상 후 일수, DA = 손상된 영역; GMR = 회백질 비율; WMR = 백질 비율; DR = 손상된 비율.
| 그룹 | 1 인치 당 점 DA (μm2) | 56 dpi DA (μm2) |
| 보통 | 0 | 0 |
| 심하지 않음 | 2391250 | 666091 |
| 온화한 | 4383381 | 1263191 |
| 아주 심함 | 5118833 | 1943962 |
표 2 : 손상 후 1 일과 56 일에 시상 절편의 병변 비교.
Discussion
표준화 된 절차를 통해 특히 작은 동물 생체 내 실험에서 안정적인 데이터를 얻을 수있어 동물 간의 개인차로 인한 결과의 편차를 최소화 할 수 있습니다. 위의 조건과 편리한 응용 기기를 기반으로 표준화되고 최소 침습적이며 정확하고 반복 가능한 SCI 모델을 설정할 수 있습니다.
실용성과 편의성으로 인해 이전에는 중량 강하 임팩터가 대부분3을 사용했습니다. 이 연구에서 소개된 임팩터는 Allen의 모델12와 동일한 원리를 공유합니다. 다행스럽게도 현대 가공 기술의 정확한 제조 이점으로 인해 연구팀은 작동하기 쉽고 안정적이며 거의 부정확하지 않은 이점을 가진 중량 강하 임팩터를 설계했습니다. 피크 압력 검출 장치를 사용하여 다양한 추의 중력을 측정했습니다. Infinite Horizons 임팩터에 대한 이전 연구6,10은 의도한 힘에서 벗어난 ±5 Kdyn 범위의 힘이 30 Kdyn, 50 Kdyn 및 70 Kdyn 그룹에서 허용된다고 보고했으며, 이는 그룹 분할 및 타박상 정도 선택 측면에서 현재 연구에 대한 참조를 제공합니다. 본 연구에서는 다른 그룹의 가능한 힘을 미리 측정하여보다 정확한 데이터를 얻었습니다.
동물 모델 실험에서 장치보다 더 중요한 것은 마우스 해부학의 이해와 활용입니다. 해부학을 잘 활용하면 절차를 최소 침습적으로 만들 수 있습니다. 최소 침습 수술은 실험 동물의 기능 상태의 안정성과 후속 마우스 회복의 일관성에 직접적인 영향을 미칩니다. 이전 연구에 따르면 SCI 모델의 최소 침습적 확립은 척추 구조의 안정성을 증가시키고 쥐1에서 회복하는 동안 척추 불안정으로 인한 추가 손상을 방지합니다. 최소 침습 수술의 전제는 자연 해부학 적 구조의 합리적인 사용입니다. 따라서 척수 분절의 신속하고 정확한 위치는 마우스의 해부학 적 구조에 따라 수행되어야합니다. 보고된 바와 같이, 영상화 방법을 사용하여 척추(13)를 찾았다. 정확도는 높지만 실제 실험 작업 과정에서 위치 파악을위한 이미징 방법은 불편한 작동, 긴 작동 시간, 복잡한 장비 획득 및 높은 장비 정확도 요구 사항의 단점이 있습니다. McDonough et al. 견갑골14의 열등한 각도를 통해 T7을 찾는 반면 마우스는 거짓말로 엎드려 행동하므로 언급 된 열등각은 후방 각도로 추정됩니다. 더욱이, T7을 찾기 위해 하부 견갑골 팁을 사용하는 것은 인체 해부학(15)의 특정 위치에 대한 위치 확인 방법이며, 이는 마우스에 적합하지 않습니다. 마지막으로, Micro-CT 데이터는 마우스가 자연 또는 특정 신체 위치에 있는지 여부에 관계없이 견갑골의 후방 각도가 T7과 같은 높이가되지 않는다는 가설을 검증했습니다. McDonough et al.14 는 또한 마우스가 아치형일 때 등의 가장 높은 지점을 찾고 가장 높은 지점을 T12로 정의하는 것에 대해 언급했습니다. 비교적으로, 본 연구에서, T9는 마우스의 자세와 관련되거나 영향을받지 않는 T12-T13 interspinous 공간의 도움으로 위치한다. 게다가, 이 방법을 사용하면 표적 척추를 쉽게 찾고 수술할 수 있습니다. 현미경으로 13번째 갈비뼈를 조사하고 늑추각 영역을 부드럽게 만지고 가시돌기를 향해 선을 그린 다음 T12-T13의 가시돌기 사이의 공간을 머리 쪽으로 조사해야 합니다. 연구팀은 T12-T13 척추 간 공간을 사용하여 12 마리의 마우스 중 T9를 찾았습니다. 마지막으로, 12마리의 암컷 C57BL/6J 마우스는 T9 위치 및 추궁 절제술 후 Micro-CT 스캔을 받았습니다. Micro-CT 스캔의 결과는 모든 12 마우스에서 제거 된 층이 T9임을 나타냅니다. Micro-CT의 결과는 모든 T9가 정확하게 위치했으며 정확도는 견갑골 위치 확인 방법보다 훨씬 높았습니다. 이 방법은 빠르고 정확한 위치 추적 방법을 제공하여 부상 모델의 일관성에 기여합니다.
본 프로토콜의 최소 침습성은 주로 세 가지 측면에서 두드러진다. 첫째, 위치 확인 후 T9 수준의 척추 주위 근육은 T8 또는 T10 수준의 근육을 손상시키지 않고 마이크로 견인기에 의해서만 수축됩니다. 또한, 마이크로 견인기에 의한 층의 노출은 시야를 방해하지 않습니다. 둘째, 대부분 후궁 절제술로 인한 혈액 손실은 해면골에서 혈액 유출을 유발할 수 있으며 수술 절차에서 매우 낮으며 2mm x 2mm x 3mm 삼각형 면 조각을 염색하는 부피보다 거의 적습니다. 셋째, 후궁 절제술은 필요한 부위로 제한하여 수행되어 얇은 판의 측면 부분의 연속성을 유지하고 척추 불안정성을 크게 약화 시켰습니다. 이전 프로토콜16, 17과 비교하여 현재 프로토콜은 불필요한 손상을 많이 줄입니다.
SCI의 다른 정도를 평가하기 위해 조직 병리학의 모든 그룹 간의 결과를 이전 연구에서 이미 9,11,18로 표시된 것과 비교했습니다. 이러한 결과는 다양한 정도의 부상과 다른 기간의 변화에 대한 관찰 연구를 완료하기에 충분합니다. HE 및 면역 형광법은 SCI의 중증도가 증가함에 따라 척수 조직에 더 비정상적인 형태가 나타나고 손상 정도의 증가로 인해 척수의 구조적 장애 정도가 증가한다는 것을 보여주었습니다. 조직 형태 관찰의 관점에서,이 연구의 각 실험 그룹에서 조직 형태 변화의 정도와 규칙 성은 이전 연구와 매우 일치합니다.
현재의 조직 학적 검사 결과에 따르면, 외상성 SCI의 정도가 다른 후 다양한 지표의 명확한 변화가 나타나며,이 연구에서 확립 된 모델의 신뢰성을 더욱 확인시켜줍니다.
기술은 정확하고 효과적이지만 방법에 잠재적인 제한이 있을 수 있습니다. 후궁 절제술과 관련하여 작업자는 실수로 척수가 손상되는 것을 방지하기 위해 현미경 수술에 능숙해야 합니다. 또한 전체 플랫폼의 설정은 기계적 구조를 기반으로하므로 자동화 된 장비에 비해 작업자에 대한 요구가 더 높습니다. 실제로, 언급 된 모든 문제는 반복적 인 작업 교육을 통해 개선 될 수 있습니다.
최소 침습적이고 표준화된 모델링은 결과를 보다 균일하고 안정적이며 반복 가능하게 만들고 다양한 치료 계획의 효능을 정확하게 평가하며 외상성 SCI에 대한 연구 계획을 최적화하는 데 도움이 된다는 것을 알 수 있습니다.
Disclosures
Shiqing Feng 교수는 척수 손상 동축 플랫폼의 소유권을 가지고 있습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 국가 핵심 프로그램 (81930070)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% fixative solution | Solarbio | P1110 | 4% |
| Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody | abcam | ab8135 | Dilution ratio (1: 2000) |
| Eosin Staining Solution (water soluble) | biosharp | BL727B | |
| Ethanol | Fuyu Reagent | 64-17-5 | |
| Fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X800 | |
| Frozen Slicer | leica | CM3050 S | |
| GFAP (GA5) Mouse mAb | Cell Signaling TECHNOLOGY | #3670 | Dilution ratio (1: 600) |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32723TR | Dilution ratio (1: 1000) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32740 | Dilution ratio (1: 1000) |
| Hematoxylin Staining Solution | biosharp | BL702A | |
| Mice | Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany | C57BL/6J | |
| Microsurgery apparatus | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | All the surgey instruments are custom-made | Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors |
| Normal sheep serum for blocking (working solution) | Zhong Shan Jin Qiao | ZLI-9022 | working solution |
| O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
| PBS (phosphate buffered solution) | Solarbio | P1020 | pH 7.2-7.4 |
| RWD Laboratory inhalation anesthetic station | RWD Life Science Co., Ltd | R550 | |
| Small animal in vivo microCT imaging system | PerkinElmer | Quantum GX2 | |
| Spinal cord injury coaxial platform | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | Custom-made(Feng's standard) | (https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~1~ b0yRFKOq&alg_id=0&slg=tagGood List-default%2COpBottom%2Cuuid %2CabTraceId&components_style_ layout=1&reft=1659409105184&sp m=g.930111970_f.81386274&alias =367x5ovgn69q18g&from_uuid=136 2cc46-ffe0-6886-2c65-01903dbacbb a&sf=qq_sm&is_share=1&shopAuto Enter=1&share_cmpt=native_ wechat&is_silence_auth=1) |
| Surgery microscope | Zumax Medical Co., Ltd. | zumax, OMS2355 | |
| TBST (Tris Buffered Saline+Tween) | Solarbio | T1082 | Dilution ratio (1: 19) |
| Xylene | Fuyu Reagent | 1330-20-7 |
References
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