Beoordeling van de vermeende anticryptokokkeneigenschappen van ruwe en geklaarde extracten van weekdieren
Summary
De menselijke schimmelpathogeen Cryptococcus neoformans produceert een verscheidenheid aan virulentiefactoren (bijv. Peptidases) om zijn overleving in de gastheer te bevorderen. Milieuniches vormen een veelbelovende bron van nieuwe natuurlijke peptidaseremmers. Dit protocol schetst de bereiding van extracten van weekdieren en de beoordeling van hun effect op de productie van schimmelvirulentiefactoren.
Abstract
Cryptococcus neoformans is een ingekapselde menselijke schimmelpathogeen met een wereldwijde verspreiding die voornamelijk immuungecompromitteerde individuen infecteert. Het wijdverbreide gebruik van antischimmelmiddelen in klinische omgevingen, hun gebruik in de landbouw en stamhybridisatie hebben geleid tot een verhoogde evolutie van resistentie. Deze stijgende mate van resistentie tegen antischimmelmiddelen is een groeiende zorg onder clinici en wetenschappers over de hele wereld, en er is een verhoogde urgentie om nieuwe antischimmeltherapieën te ontwikkelen. C. neoformans produceert bijvoorbeeld verschillende virulentiefactoren, waaronder intra- en extracellulaire enzymen (bijv. Peptidasen) met rollen in weefselafbraak, cellulaire regulatie en verwerving van voedingsstoffen. De verstoring van dergelijke peptidase-activiteit door remmers verstoort schimmelgroei en -proliferatie, wat suggereert dat dit een belangrijke strategie kan zijn om de ziekteverwekker te bestrijden. Belangrijk is dat ongewervelde dieren zoals weekdieren peptidaseremmers produceren met biomedische toepassingen en antimicrobiële activiteit, maar ze zijn onderbelicht in termen van hun gebruik tegen schimmelpathogenen. In dit protocol werd een wereldwijde extractie uit weekdieren uitgevoerd om potentiële peptidaseremmers in ruwe en geklaarde extracten te isoleren, en hun effecten tegen klassieke cryptokokkenvirulentiefactoren werden beoordeeld. Deze methode ondersteunt de prioritering van weekdieren met schimmelwerende eigenschappen en biedt mogelijkheden voor de ontdekking van antivirulentiemiddelen door gebruik te maken van de natuurlijke remmers die in weekdieren worden aangetroffen.
Introduction
Cryptococcus neoformans is een menselijke schimmelpathogeen die ernstige ziekten veroorzaakt bij immuungecompromitteerde gastheren, zoals personen die leven met HIV / AIDS1, en leidt tot ongeveer 19% van de AIDS-gerelateerde sterfgevallen2. De schimmel is gevoelig voor verschillende klassen van antischimmelmiddelen, waaronder azolen, polyenen en flucytosine, die fungicide en fungistatische activiteit uitoefenen met behulp van verschillende mechanismen 3,4. Het uitgebreide gebruik van antischimmelmiddelen in klinische en agrarische omgevingen in combinatie met stamhybridisatie heeft echter de evolutie van resistentie bij meerdere schimmelsoorten, waaronder C. neoformans5, versterkt.
Om de uitdagingen van antischimmelresistentie te overwinnen en de prevalentie van schimmelinfecties op wereldwijde schaal te verminderen, is een veelbelovende aanpak om de virulentiefactoren van Cryptococcus spp. (bijv. Temperatuuraanpassingsvermogen, polysaccharidecapsule, melanine en extracellulaire enzymen) te gebruiken als potentiële therapeutische doelen 4,6 . Deze aanpak heeft verschillende voordelen, omdat deze virulentiefactoren goed worden gekarakteriseerd in de literatuur, en het richten op deze factoren zou mogelijk de snelheid van antischimmelresistentie kunnen verminderen door een zwakkere selectieve druk op te leggen door de virulentie te verminderen in plaats van zich te richten op celgroei6. In deze context hebben talrijke studies de mogelijkheid beoordeeld om zich te richten op extracellulaire enzymen (bijv. Proteasen, peptidasen) om de virulentie van Cryptococcus spp.7,8,9 te verminderen of te remmen.
Organismen zoals ongewervelde dieren en planten beschikken niet over een adaptief immuunsysteem om zichzelf te beschermen tegen ziekteverwekkers. Ze vertrouwen echter op een sterk aangeboren immuunsysteem met een immens scala aan chemische verbindingen om micro-organismen en roofdieren aan te pakken10. Deze moleculen omvatten peptidaseremmers, die een belangrijke rol spelen in veel biologische systemen, waaronder de cellulaire processen van ongewervelde immuniteit, zoals de coagulatie van hemolymfe, de synthese van cytokines en antimicrobiële peptiden, en de bescherming van gastheren door de proteasen van pathogenen direct te inactiveren11. Peptidaseremmers van ongewervelde dieren zoals weekdieren hebben dus potentiële biomedische toepassingen, maar velen blijven onkarakteriseerd10,12,13. In deze context zijn er ongeveer 34 soorten landweekdieren in Ontario en 180 zoetwaterweekdieren in Canada14. Hun diepgaande profilering en karakterisering zijn echter nog steeds beperkt15. Deze organismen bieden een kans voor de identificatie van nieuwe verbindingen met potentiële antischimmelactiviteit10.
In dit protocol worden methoden beschreven om extracten van ongewervelde dieren (bijv. weekdieren) te isoleren en te verduidelijken (figuur 1), gevolgd door het meten van de vermeende peptidase-remmende activiteit. De antischimmeleigenschappen van deze extracten worden vervolgens beoordeeld door hun impact op de virulentiefactorproductie van C. neoformans te meten met behulp van fenotypische assays (figuur 2). Het is belangrijk op te merken dat verschillen in antischimmeleigenschappen tussen ruwe en geklaarde extracten indicatief kunnen zijn voor microbiële factoren (bijv. Secundaire metabolieten of toxines geproduceerd door het gastheermicrobioom) van het weekdier, die experimentele observaties kunnen beïnvloeden. Dergelijke bevindingen ondersteunen de noodzaak voor dit protocol om zowel ruwe als geklaarde extracten onafhankelijk te beoordelen om de werkingsmechanismen te ontrafelen. Bovendien is het extractieproces onbevooroordeeld en kan het de detectie van antimicrobiële eigenschappen tegen een overvloed aan schimmel- en bacteriële pathogenen mogelijk maken. Daarom biedt dit protocol een initiatiepunt voor de prioritering van weekdiersoorten met schimmelwerende eigenschappen tegen C. neoformans en een mogelijkheid om de verbindingen tussen enzymatische activiteit en virulentiefactorproductie te evalueren door middel van vermeende remmende mechanismen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven extractieprotocol schetst de isolatie van verbindingen uit weekdieren verzameld uit Ontario, Canada, en toont een nieuw onderzoek naar het gebruik van weekdierextracten tegen de menselijke schimmelpathogeen, C. neoformans. Dit protocol draagt bij aan een groeiend aantal onderzoeken naar de activiteit van peptidaseremmers van ongewervelde dieren13. Tijdens de extractie waren sommige extractmonsters moeilijk te filteren-steriliseren, mogelijk vanwege de aanwezigheid van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken leden van het Geddes-McAlister Lab voor hun waardevolle steun tijdens dit onderzoek en hun manuscriptfeedback. De auteurs erkennen de financiële steun van de Ontario Graduate Scholarship en International Graduate Research Award – University of Guelph tot D. G.-G en van de Canadian Foundation of Innovation (JELF 38798) en Ontario Ministry of Colleges and Universities – Early Researcher Award voor J. G.-M.
Materials
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
References
- Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
- Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adults in 2020: a modelling analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2022).
- Mourad, A., Perfect, J. R. Present and future therapy of Cryptococcus infections. Journal of Fungi. 4 (3), 79 (2018).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of antifungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. 114 (5), 721-734 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. 1435 (1), 57-78 (2019).
- Kronstad, J. W., Hu, G., Choi, J. The cAMP/protein kinase A pathway and virulence in Cryptococcus neoformans. Mycobiology. 39 (3), 143-150 (2018).
- Olszewski, M. A., et al. Urease expression by Cryptococcus neoformans promotes microvascular sequestration, thereby enhancing central nervous system invasion. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1761-1771 (2004).
- Shi, M., et al. Real-time imaging of trapping and urease-dependent transmigration of Cryptococcus neoformans in mouse brain. The Journal of Clinical Investigation. 120 (5), 1683-1693 (2010).
- Vu, K., et al. Invasion of the central nervous system by Cryptococcus neoformans requires a secreted fungal metalloprotease. mBio. 5 (3), 01101-01114 (2014).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. From naturally-sourced protease inhibitors to new treatments for fungal infections. Journal of Fungi. 7 (12), 1016 (2021).
- Nakao, Y., Fusetani, N. Enzyme inhibitors from marine invertebrates. Journal of Natural Products. 70 (4), 689-710 (2007).
- Reytor, M. L., et al. Screening of protease inhibitory activity in extracts of five Ascidian species from Cuban coasts. Biotecnologia Aplicada. 28 (2), 77-82 (2011).
- González, L., et al. Screening of protease inhibitory activity in aqueous extracts of marine invertebrates from Cuban coast. American Journal of Analytical Chemistry. 7 (4), 319-331 (2016).
- Brown, D. S., Werger, M. J. A. Freshwater molluscs. Biogeography and Ecology of Southern Africa. , 1153-1180 (1978).
- Forsyth, R. G., Oldham, M. J. Terrestrial molluscs from the Ontario Far North. Check List. 12 (3), 1-51 (2016).
- Eigenheer, R. A., Lee, Y. J., Blumwald, E., Phinney, B. S., Gelli, A. Extracellular glycosylphosphatidylinositol-anchored mannoproteins and proteases of Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Research. 7 (4), 499-510 (2007).
- Homer, C. M., et al. Intracellular action of a secreted peptide required for fungal virulence. Cell Host & Microbe. 19 (6), 849-864 (2016).
- Clarke, S. C., et al. Integrated activity and genetic profiling of secreted peptidases in Cryptococcus neoformans reveals an aspartyl peptidase required for low pH survival and virulence. PLoS Pathogens. 12 (12), 1006051 (2016).
- Copeland, R. A. . Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacologists. , (2013).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46, 624-632 (2018).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. Peptidases: Promising antifungal targets of the human fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. Facets. 7 (1), 319-342 (2022).
- Martinez, L. R., Casadevall, A. Susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (3), 1021-1033 (2006).
- Culp, E., Wright, G. D. Bacterial proteases, untapped antimicrobial drug targets. Journal of Antibiotics. 70 (4), 366-377 (2017).
- Ruocco, N., Costantini, S., Palumbo, F., Costantini, M. Marine sponges and bacteria as challenging sources of enzyme inhibitors for pharmacological applications. Mar Drugs. 15 (6), 173 (2017).
- Costa, H. P. S., et al. JcTI-I: A novel trypsin inhibitor from Jatropha curcas seed cake with potential for bacterial infection treatment. Frontiers in Microbiology. 5, 5 (2014).
