أتمتة مقايسة النواة الدقيقة باستخدام قياس التدفق الخلوي للتصوير والذكاء الاصطناعي
Summary
اختبار النواة الدقيقة (MN) هو اختبار راسخ لقياس تلف الحمض النووي. ومع ذلك ، فإن تسجيل الفحص باستخدام التقنيات التقليدية مثل الفحص المجهري اليدوي أو تحليل الصور المستند إلى الميزات أمر شاق وصعب. تصف هذه الورقة منهجية تطوير نموذج ذكاء اصطناعي لتسجيل مقايسة MN باستخدام بيانات قياس التدفق الخلوي للتصوير.
Abstract
يتم استخدام اختبار النواة الدقيقة (MN) في جميع أنحاء العالم من قبل الهيئات التنظيمية لتقييم المواد الكيميائية للسمية الجينية. يمكن إجراء الفحص بطريقتين: عن طريق تسجيل MN في الخلايا ثنائية النواة المقسمة مرة واحدة أو المسدودة بالسيتوكينات أو الخلايا أحادية النوى المقسمة بالكامل. تاريخيا ، كان الفحص المجهري الضوئي هو الطريقة القياسية الذهبية لتسجيل الفحص ، لكنه شاق وغير موضوعي. تم استخدام قياس التدفق الخلوي في السنوات الأخيرة لتسجيل الفحص ، ولكنه محدود بسبب عدم القدرة على تأكيد الجوانب الرئيسية للصور الخلوية بصريا. يجمع قياس التدفق الخلوي التصويري (IFC) بين التقاط الصور عالية الإنتاجية وتحليل الصور الآلي ، وقد تم تطبيقه بنجاح للحصول بسرعة على صور لجميع الأحداث الرئيسية وتسجيلها في اختبار MN. في الآونة الأخيرة ، ثبت أنه يمكن استخدام طرق الذكاء الاصطناعي (الذكاء الاصطناعي) القائمة على الشبكات العصبية التلافيفية لتسجيل بيانات مقايسة MN التي حصلت عليها مؤسسة التمويل الدولية. تصف هذه الورقة جميع خطوات استخدام الذكاء الاصطناعي البرنامج لإنشاء نموذج تعلم عميق لتسجيل جميع الأحداث الرئيسية وتطبيق هذا النموذج لتسجيل بيانات إضافية تلقائيا. تقارن نتائج نموذج التعلم العميق الذكاء الاصطناعي بشكل جيد بالفحص المجهري اليدوي ، وبالتالي تمكين التسجيل الآلي بالكامل لمقايسة MN من خلال الجمع بين مؤسسة التمويل الدولية و الذكاء الاصطناعي.
Introduction
يعد فحص النواة الدقيقة (MN) أمرا أساسيا في علم السموم الوراثية لتقييم تلف الحمض النووي في تطوير مستحضرات التجميل والمستحضرات الصيدلانية والمواد الكيميائية للاستخدام البشري1،2،3،4. تتكون النوى الدقيقة من كروموسومات كاملة أو شظايا كروموسوم لا تندمج في النواة بعد الانقسام وتتكثف في أجسام دائرية صغيرة منفصلة عن النواة. وبالتالي ، يمكن استخدام MN كنقطة نهاية لتحديد تلف الحمض النووي في اختبار السمية الجينية1.
الطريقة المفضلة لقياس MN هي داخل الخلايا ثنائية النواة المقسمة مرة واحدة (BNCs) عن طريق منع الانقسام باستخدام Cytochalasin-B (Cyt-B). في هذا الإصدار من الفحص ، يتم تقييم السمية الخلوية أيضا عن طريق تسجيل الخلايا أحادية النواة (MONO) ومتعددة النوى (POLY). يمكن أيضا إجراء الفحص عن طريق تسجيل MN في خلايا أحادية اللون غير محظورة ، وهو أسرع وأسهل في التسجيل ، مع تقييم السمية الخلوية باستخدام عدد الخلايا قبل وبعد التعرض لتقييم الانتشار 5,6.
تم إجراء التسجيل المادي للفحص تاريخيا من خلال الفحص المجهري اليدوي ، لأن هذا يسمح بتأكيد مرئي لجميع الأحداث الرئيسية. ومع ذلك ، فإن الفحص المجهري اليدوي يمثل تحديا وشخصيا1. وهكذا ، تم تطوير تقنيات آلية ، بما في ذلك مسح الشرائح المجهرية وقياس التدفق الخلوي ، ولكل منها مزاياها وقيودها. بينما تسمح طرق مسح الشرائح بتصور الأحداث الرئيسية ، يجب إنشاء الشرائح بكثافة الخلية المثلى ، والتي قد يكون من الصعب تحقيقها. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تفتقر هذه التقنية إلى التصور السيتوبلازمي ، والذي يمكن أن يضر بتسجيل الخلايا أحادية اللونو POLY 7,8. بينما يوفر قياس التدفق الخلوي التقاط بيانات عالية الإنتاجية ، يجب تحليل الخلايا ، وبالتالي عدم السماح باستخدام شكل Cyt-B للفحص. بالإضافة إلى ذلك ، كتقنية غير تصويرية ، لا يوفر قياس التدفق الخلوي التقليدي التحقق البصري من الأحداث الرئيسية 9,10.
لذلك ، تم التحقيق في قياس التدفق الخلوي التصويري (IFC) لإجراء فحص MN. تجمع ImageStreamX Mk II بين السرعة والمتانة الإحصائية لقياس التدفق الخلوي التقليدي مع إمكانات التصوير عالية الدقة للفحص المجهري في نظام واحد11. لقد ثبت أنه باستخدام مؤسسة التمويل الدولية ، يمكن التقاط صور عالية الدقة لجميع الأحداث الرئيسية وتسجيلها تلقائيا باستخدام تقنيات 12,13 أو الذكاء الاصطناعي (الذكاء الاصطناعي)القائمة على الميزات 14,15. باستخدام IFC لإجراء مقايسة MN ، يمكن تحقيق التسجيل التلقائي للعديد من الخلايا مقارنة بالفحص المجهري في فترة زمنية أقصر.
ينحرف هذا العمل عن سير عمل تحليل الصور الموصوف سابقا16 ويناقش جميع الخطوات المطلوبة لتطوير وتدريب نموذج غابة عشوائية (RF) و / أو شبكة عصبية تلافيفية (CNN) باستخدام برنامج Amnis الذكاء الاصطناعي (يشار إليه من الآن فصاعدا باسم “برنامج الذكاء الاصطناعي”). يتم وصف جميع الخطوات اللازمة ، بما في ذلك ملء بيانات الحقيقة الأرضية باستخدام أدوات وضع العلامات بمساعدة الذكاء الاصطناعي ، وتفسير نتائج تدريب النموذج ، وتطبيق النموذج لتصنيف البيانات الإضافية ، مما يسمح بحساب السمية الجينية والسمية الخلوية15.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف العمل المقدم هنا استخدام خوارزميات التعلم العميق لأتمتة تسجيل مقايسة MN. أظهرت العديد من المنشورات الحديثة أن الأدوات البديهية والتفاعلية تسمح بإنشاء نماذج التعلم العميق لتحليل بيانات الصور دون الحاجة إلى معرفة حسابية متعمقة18,19. تم تصميم البروتوكول ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
اي.
Materials
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
| Corning bottle-top vacuum filter | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 µm filter, 500 mL bottle |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg bottle |
| Debubbler – 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Free |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solution |
| Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC – ImageStreamX Mark II | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used. |
| MIFC analysis software – IDEAS | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image analysis sofware" The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| MIFC software – INSPIRE | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image acquisition software" This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Amnis AI software | Luminex, a DiaSorin company | 100221 | "AI software" This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data |
| Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
| NEAA Mixture 100x | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
| Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
| Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | Use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath – PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Sterile water | HyClone | SH30529.01 | |
| Sterilizer – 0.4%–0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| T25 flask | Falcon | 353109 | |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TK6 cells | MilliporeSigma | 95111735 |
References
- Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
- OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , (2016).
- Fenech, M. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).
- Bonassi, S., et al. An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans. Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).
- Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
- Fenech, M. Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).
- Seager, A. L., et al. Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells. Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).
- Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure. Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).
- Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).
- Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability. Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).
- Basiji, D. A. Principles of Amnis imaging flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).
- Rodrigues, M. A. Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream® imaging flow cytometer. Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).
- Verma, J. R., et al. Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro. Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).
- Wills, J. W., et al. Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).
- Rodrigues, M. A., et al. The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).
- Rodrigues, M. A. An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).
- Lovell, D. P., et al. Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Hennig, H., et al. An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning. Methods. 112, 201-210 (2017).
