Automatisering af mikronukleusanalysen ved hjælp af billeddannelsesflowcytometri og kunstig intelligens
Summary
Mikronukleusanalysen (MN) er en veletableret test til kvantificering af DNA-skader. Imidlertid er det besværligt og udfordrende at score analysen ved hjælp af konventionelle teknikker såsom manuel mikroskopi eller funktionsbaseret billedanalyse. Dette papir beskriver metoden til at udvikle en kunstig intelligensmodel til at score MN-analysen ved hjælp af billeddannelsesflowcytometridata.
Abstract
Mikrokerneanalysen (MN) anvendes over hele verden af regulerende organer til at evaluere kemikalier for genetisk toksicitet. Analysen kan udføres på to måder: ved at score MN i en gang opdelte, cytokinesisblokerede binucleerede celler eller fuldt opdelte mononukleerede celler. Historisk set har lysmikroskopi været guldstandardmetoden til at score analysen, men det er besværligt og subjektivt. Flowcytometri er blevet brugt i de senere år til at score analysen, men er begrænset af manglende evne til visuelt at bekræfte nøgleaspekter af cellulære billeder. Imaging flow cytometri (IFC) kombinerer high-throughput billedoptagelse og automatiseret billedanalyse, og er blevet anvendt med succes til hurtigt at erhverve billeder af og score alle vigtige begivenheder i MN assay. For nylig er det blevet demonstreret, at kunstig intelligens (AI) metoder baseret på convolutional neurale netværk kan bruges til at score MN assay data erhvervet af IFC. Dette dokument beskriver alle trin til at bruge AI-software til at oprette en dyb læringsmodel til at score alle vigtige hændelser og til at anvende denne model til automatisk at score yderligere data. Resultaterne fra AI deep learning-modellen kan sammenlignes godt med manuel mikroskopi, hvilket muliggør fuldautomatisk scoring af MN-analysen ved at kombinere IFC og AI.
Introduction
Mikrokerneanalysen (MN) er grundlæggende i genetisk toksikologi til evaluering af DNA-skader i udviklingen af kosmetik, lægemidler og kemikalier til human brug 1,2,3,4. Mikrokerner dannes af hele kromosomer eller kromosomfragmenter, der ikke inkorporeres i kernen efter opdeling og kondenseres til små, cirkulære legemer adskilt fra kernen. MN kan således anvendes som endepunkt til at kvantificere DNA-skader i genotoksicitetstest1.
Den foretrukne metode til kvantificering af MN er inden for en gang delte binucleated celler (BNC’er) ved at blokere division ved hjælp af cytochalasin-B (Cyt-B). I denne version af analysen vurderes cytotoksicitet også ved at score mononukleerede (MONO) og polynukleerede (POLY) celler. Analysen kan også udføres ved at score MN i ikke-blokerede MONO-celler, hvilket er hurtigere og lettere at score, idet cytotoksicitet vurderes ved hjælp af celletal før og efter eksponering for at vurdere proliferation 5,6.
Fysisk scoring af analysen er historisk set blevet udført gennem manuel mikroskopi, da dette muliggør visuel bekræftelse af alle nøglehændelser. Imidlertid er manuel mikroskopi udfordrende og subjektiv1. Således er automatiserede teknikker blevet udviklet, herunder mikroskopdiasscanning og flowcytometri, hver med deres egne fordele og begrænsninger. Mens diasscanningsmetoder gør det muligt at visualisere nøglehændelser, skal dias oprettes med optimal celletæthed, hvilket kan være vanskeligt at opnå. Derudover mangler denne teknik ofte cytoplasmatisk visualisering, hvilket kan kompromittere scoringen af MONO- og POLY-celler 7,8. Mens flowcytometri tilbyder datafangst med høj kapacitet, skal cellerne lyseres, hvilket ikke tillader anvendelse af Cyt-B-formen af assayet. Derudover giver konventionel flowcytometri som en ikke-billeddannelsesteknik ikke visuel validering af nøglehændelser 9,10.
Derfor er billeddannelsesflowcytometri (IFC) blevet undersøgt for at udføre MN-assayet. ImageStreamX Mk II kombinerer hastigheden og den statistiske robusthed af konventionel flowcytometri med mikroskopiens billeddannelsesfunktioner i høj opløsning i et enkelt system11. Det har vist sig, at ved hjælp af IFC kan billeder i høj opløsning af alle nøglebegivenheder optages og automatisk scores ved hjælp af funktionsbaserede 12,13 eller kunstig intelligens (AI) teknikker14,15. Ved at bruge IFC til at udføre MN-analysen kan den automatiske scoring af mange flere celler sammenlignet med mikroskopi på kortere tid opnås.
Dette arbejde afviger fra en tidligere beskrevet billedanalysearbejdsgang16 og diskuterer alle trin, der kræves for at udvikle og træne en Random Forest (RF) og / eller convolutional neural network (CNN) model ved hjælp af Amnis AI-softwaren (fremover benævnt “AI-software”). Alle nødvendige trin er beskrevet, herunder udfyldning af grundlæggende sandhedsdata ved hjælp af AI-assisterede mærkningsværktøjer, fortolkning af modeltræningsresultater og anvendelse af modellen til at klassificere yderligere data, hvilket muliggør beregning af genotoksicitet og cytotoksicitet15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Arbejdet, der præsenteres her, beskriver brugen af deep learning-algoritmer til at automatisere scoringen af MN-analysen. Flere nylige publikationer har vist, at intuitive, interaktive værktøjer gør det muligt at oprette deep learning-modeller til at analysere billeddata uden behov for dybdegående beregningsviden18,19. Protokollen beskrevet i dette arbejde ved hjælp af en brugergrænsefladedrevet softwarepakke er designet til at fungere godt med meget store…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen.
Materials
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
| Corning bottle-top vacuum filter | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 µm filter, 500 mL bottle |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg bottle |
| Debubbler – 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Free |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solution |
| Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC – ImageStreamX Mark II | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used. |
| MIFC analysis software – IDEAS | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image analysis sofware" The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| MIFC software – INSPIRE | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image acquisition software" This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Amnis AI software | Luminex, a DiaSorin company | 100221 | "AI software" This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data |
| Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
| NEAA Mixture 100x | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
| Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
| Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | Use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath – PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Sterile water | HyClone | SH30529.01 | |
| Sterilizer – 0.4%–0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| T25 flask | Falcon | 353109 | |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TK6 cells | MilliporeSigma | 95111735 |
References
- Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
- OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , (2016).
- Fenech, M. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).
- Bonassi, S., et al. An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans. Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).
- Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
- Fenech, M. Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).
- Seager, A. L., et al. Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells. Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).
- Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure. Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).
- Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).
- Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability. Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).
- Basiji, D. A. Principles of Amnis imaging flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).
- Rodrigues, M. A. Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream® imaging flow cytometer. Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).
- Verma, J. R., et al. Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro. Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).
- Wills, J. W., et al. Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).
- Rodrigues, M. A., et al. The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).
- Rodrigues, M. A. An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).
- Lovell, D. P., et al. Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Hennig, H., et al. An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning. Methods. 112, 201-210 (2017).
