नोट: बाँझ संस्कृति ग्लासवेयर, पिपेट टिप्स और विकास माध्यम का उपयोग करें। कोलाई कोशिकाओं को कम-ऑटोफ्लोरेसेंस रासायनिक रूप से परिभाषित माध्यम में उगाया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए एक बनसेन बर्नर की उपस्थिति में टीकाकरण किया गया था। 1. सेल संस्कृति और विकास वक्र लुरिया-बर्टानी (एलबी) एगर प्लेट (यदि आवश्यक हो तो चयनात्मक एंटीबायोटिक के साथ पूरक) पर जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक से रुचि के तनाव को दूर करें, और एकल उपनिवेश प्राप्त करने के लिए रात भर (15 घंटे और 19 घंटे के बीच) 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।नोट: यहां प्रस्तुत प्रयोग दो उपभेदों का उपयोग करता है, ई कोलाई के -12 एमजी 1655 डब्ल्यूटी तनाव के अनुरूप और इसोजेनिक एमजी 1655 एचयूपीए-एमचेरी स्ट्रेन22। उत्तरार्द्ध तनाव एचयू न्यूक्लियोइड से जुड़े प्रोटीन के प्रतिदीप्ति-टैग α-सबयूनिट को व्यक्त करता है। एचयूपीए-एमचेरी रिपोर्टर हूपा के मूल स्थान पर एकीकृत है। एचयू-एमचेरी जीवित कोशिकाओं में न्यूक्लियोइड गतिशीलता का पालन करने के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में कार्य करता है क्योंकि यह गैर-विशिष्ट तरीके से डीएनए को बांधता है। 5 एमएल माध्यम का टीका लगाएं (यहां, 3-[एन-मोर्फोलिनो] प्रोपेनसल्फोनिक एसिड-आधारित माध्यम [एमओपीएस]; तालिका 1, तालिका 2, और तालिका 3) को ग्लास ट्यूब (≥25 एमएल) में एक पृथक कॉलोनी के साथ ग्लूकोज 0.4% और एक चयनात्मक एंटीबायोटिक (यदि आवश्यक हो) के साथ पूरक किया जाता है, और ट्यूब को रात भर (15 घंटे और 19 घंटे के बीच) 37 डिग्री सेल्सियस और 180 रोटेशन प्रति मिनट (आरपीएम) पर सेट किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, ग्लास ट्यूबों के बजाय प्लास्टिक ट्यूब, ग्लास या प्लास्टिक फ्लास्क (≥ 25 एमएल) का उपयोग किया जा सकता है।नोट: 0.4% की अंतिम सांद्रता पर ग्लिसरॉल के साथ पूरक एमओपीएस माध्यम का उपयोग इस पेपर में वर्णित प्रयोगों में किया गया था, रात भर की संस्कृतियों को छोड़कर जो एमओपीएस ग्लूकोज 0.4% में किए गए थे। ग्लूकोज के साथ पूरक एमओपीएस में ई कोलाई का उत्पादन समय एमओपीएस ग्लिसरॉल की तुलना में कम है। इस चरण में एमओपीएस ग्लिसरॉल 0.4% के बजाय एमओपीएस ग्लूकोज 0.4% का उपयोग करना यह सुनिश्चित करता है कि कोशिकाएं 19 घंटे के भीतर स्थिर चरण तक पहुंच जाएं। अन्य विकास मीडिया, जैसे कि एम 9 या समृद्ध परिभाषित माध्यम (आरडीएम) को अलग-अलग कार्बन स्रोतों के साथ पूरक किया जा सकता है, का भी उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि विकास दर और दृढ़ता आवृत्ति माध्यम और /या उपयोग किए गए कार्बन के आधार पर अलग-अलग हैं। अगली सुबह, सेंट्रीफ्यूज 1 एमएल कल्चर 3 मिनट के लिए 2,300 x g पर, सतह पर तैरने वाला छोड़ दें, और धीरे से फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) की समान मात्रा में गोली को फिर से निलंबित करें। ऑप्टिकल घनत्व को 600 एनएम (ओडी600 एनएम) पर मापें, और 2 एमएल की अंतिम मात्रा में0.01 के प्रारंभिक ओडी 600 एनएम के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करें। एमओपीएस ग्लिसरॉल के 2 एमएल 0.4% मध्यम को एक स्पष्ट निचले 24-वेल प्लेट के कुएं में रखें, और रात भर की संस्कृति मात्रा के साथ गणना की गई। 24 घंटे के लिए ओडी600 एनएम की निगरानी करने के लिए एक स्वचालित माइक्रोप्लेट रीडर (सामग्री की तालिका देखें) में 24-वेल प्लेट रखें। 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर और उच्च कक्षीय रोटेशन (140 आरपीएम) के साथ हर 15 मिनट में ओडी600 एनएम को मापने के लिए माइक्रोप्लेट रीडर सेट करें।नोट: यदि प्रयोग में उपयोग किया जाने वाला तनाव एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर को एन्कोड करता है, तो सुनिश्चित करें कि इसकी वृद्धि दर बाद के प्रयोगों में किसी भी कलाकृति से बचने के लिए डब्ल्यूटी के बराबर है, क्योंकि विकास दर एंटीबायोटिक दृढ़ता आवृत्ति23 को प्रभावित करती है। कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) संबंध पर बहुत कम सेल घनत्व पर पहचान सीमाओं औरसंभावित तनाव-विशिष्ट प्रभावों के कारण, अस्पष्ट उपभेदों के साथ काम करते समय सीएफयू-एमएल -1 की निगरानी करके विकास कैनेटीक्स का मूल्यांकन करने की सिफारिश की जाती है। 2. एंटीबायोटिक दवाओं की न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता का निर्धारण नोट: न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) को एंटीबायोटिक की सबसे कम खुराक के रूप में परिभाषित किया गया है जिस पर कोई जीवाणु वृद्धि नहीं देखी जाती है। प्रत्येक एंटीबायोटिक और तनाव के लिए एमआईसी का निर्धारण किया जाना चाहिए। यहां वर्णित प्रयोगों में, फ्लोरोक्विनोलोन एंटीबायोटिक ऑफलॉक्सासिन (ओएफएक्स) का उपयोग किया गया था। एमआईसी का निर्धारण पुष्टि के लिए अनुमति देता है कि एंटीबायोटिक समाधान सही ढंग से तैयार किया गया है, एंटीबायोटिक सक्रिय है, और उपभेद एंटीबायोटिक के प्रति समान रूप से संवेदनशील हैं। यहां,24 का उपयोग किए गए विभिन्न उपभेदों के एमआईसी से ओएफएक्स को निर्धारित करने के लिए प्रकाशित एगर तनुकरण विधि का प्रदर्शन किया गया था। किसी दिए गए जीवाणु तनाव के लिए दिए गए एंटीबायोटिक के एमआईसी को शोरबा कमजोर पड़ने की विधि24 के माध्यम से भी निर्धारित किया जा सकता है। एमआईसी निर्धारण के लिए प्लेटों की तैयारीअल्ट्राप्योर पानी के 1 एमएल में 5 मिलीग्राम ओएफएक्स को घोलकर प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले एंटीबायोटिक के लिए एक मास्टर स्टॉक समाधान तैयार करें। OFX की घुलनशीलता बढ़ाने के लिए 37% HCl का 20 μL जोड़ें। 100 एमएल बाँझ एलबी एगर पिघलाएं, और जमने से बचने के लिए इसे 55 डिग्री सेल्सियस पर रखें। बाँझ पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक फ्लास्क में छह छोटे ग्लास फ्लास्क (25 एमएल) और 5 एमएल तरल एलबी एगर माध्यम तैयार करें। अल्ट्राप्योर पानी के 90 μL (मास्टर स्टॉक का 1: 10 कमजोर पड़ना) में 5 mg.mL-1 OFX मास्टर स्टॉक समाधान के 10 μL को पतला करें। 5 0 μl, 2 μL, 4 μL, 6 μL, 8 μL, या 500 μg.mL-1 OFX घोल में से प्रत्येक में 5 mL LB agar माध्यम वाले 5 mL l agar माध्यम वाले 0 μg.mL-1, 0.02 μl-mL-1, 0.04 μg.mL-1, 0.04 μg.mL-1, 0.04 μg.mL-1, 0.04 μg.mL-1, 0.04 μll-1, 0.04 μll-1, 0.04 μl,6l,8 μL, 6 μL, 8 μL, 8 μL, या 10 μL 500 μg.mL-1, 0.04 μl l-1, 0.04 μll-1, 0.04 μll-1, 0.02 μL, 6 μL, 8 μL, 6 μL, 8 μL, 8 μL, या 10 μL 5g.mL-1 OFX घोल में से प्रत्येक में 5 mL L lg-1, 0.04 μL ll-1, 0. 0.06 μg.mL-1, 0.08 μg.mL-1, और 0.1 μg.mL-1 OFX, क्रमशः। फ्लास्क को कई बार घुमाकर घोल को मिलाएं।नोट: यदि रुचि के एंटीबायोटिक का एमआईसी ज्ञात है, तो सांद्रता की सीमा वास्तविक एमआईसी के नीचे से ऊपर तक पहुंचनी चाहिए। यदि एमआईसी अज्ञात है, तो लॉग2 कमजोर पड़ने की श्रृंखला के साथ सांद्रता की एक बड़ी श्रृंखला की सिफारिश की जाती है। सुनिश्चित करें कि एंटीबायोटिक जोड़ने से पहले एलबी आगर माध्यम ठंडा हो गया है, क्योंकि उच्च तापमान इसे निष्क्रिय कर सकता है। फिर भी, एंटीबायोटिक जोड़ने से पहले एलबी एगर माध्यम को ठोस नहीं होने देना महत्वपूर्ण है, क्योंकि इससे एलबी एगर माध्यम में एंटीबायोटिक का गैर-समरूप वितरण हो सकता है। चरण 2.1.3 में तैयार किए गए छह एलबी एगर मीडिया में से प्रत्येक को एक बाँझ पिपेट का उपयोग करके 6-वेल कल्चर प्लेट में खुराक बढ़ाने वाले तरीके से डालें। आगर को जमने तक ठंडा होने दें, और उपयोग करने से पहले प्लेट को सुखाएं।नोट: एंटीबायोटिक समाधान तैयार करें, और जिस दिन परख का प्रदर्शन किया जाता है, उस दिन संस्कृति प्लेट। एमआईसी निर्धारण परखएक ग्लास ट्यूब (≥25 एमएल) में एक पृथक कॉलोनी के साथ एलबी माध्यम के 5 एमएल को टीका लगाएं, और ग्लास ट्यूब को रात भर (15 घंटे और 19 घंटे के बीच) 37 डिग्री सेल्सियस और 180 आरपीएम पर सेट एक हिलने वाले इनक्यूबेटर में रखें। अगली सुबह, ओडी600 एनएम को मापें, और पीबीएस में 1 x 107 सीएफयू-एमएल – 1 के अंतिम सेल घनत्व के लिए एक टेस्ट ट्यूब में संस्कृति को पतला करें। यहां परीक्षण किए गए उपभेदों के लिए, 1 x 107 CFU.mL-1 0.0125 के OD 600 nm से मेल खाता है।नोट: यदि सीएफयूएमएल -1 और ओडी600 एनएम के बीच सहसंबंध ज्ञात नहीं है, तो सीएफयू और ओडी600 एनएम माप द्वारा निर्धारित विकास वक्र को सीएफयू-एमएल -1 और ओडी600 एनएम के बीच सहसंबंध कारक की गणना करने के लिए स्थापित किया जाना चाहिए। सूखे 6-वेल प्लेट के हर कुएं पर पहले से पतला संस्कृति का स्पॉट 2 μL। प्लेट को रात भर (15 घंटे और 19 घंटे के बीच) 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखने से पहले धब्बों को सूखने दें। अगले दिन, प्रत्येक कुएं में बनने वाली कॉलोनियों की गिनती करें। एमआईसी एंटीबायोटिक की न्यूनतम एकाग्रता के साथ कुएं से मेल खाता है जहां कोई जीवाणु वृद्धि का पता नहीं चलता है। 3. स्पॉट परख नोट: स्पॉट परख विधि एक गुणात्मक दृष्टिकोण है जो व्यवहार्य कोशिकाओं (एंटीबायोटिक तनाव के बाद कॉलोनियों को उत्पन्न करने में सक्षम कोशिकाओं) की संख्या का अनुमान लगाने की अनुमति देता है। स्पॉट परख को टाइम-किल परख से पहले किया जाता है ताकि परीक्षण की गई स्थितियों में उपयोग किए जाने वाले तनाव की व्यवहार्यता में अंतर्दृष्टि प्रदान की जा सके और टाइम-किल परख के दौरान आवश्यक कमजोर पड़ने के बारे में सूचित किया जा सके (अनुभाग 4 देखें)। स्पॉट परख के लिए एलबी एगर प्लेटों को तैयार करने के लिए, एक वर्ग पेट्री डिश (144 सेमी2) में 50 एमएल एलबी एगर डालें। प्रति समय बिंदु एक चौकोर पेट्री डिश तैयार करें। एलबी एगर को जमने दें, और उपयोग करने से पहले प्लेटों को सुखाएं। एक ग्लास ट्यूब (≥25 एमएल) में एक पृथक कॉलोनी के साथ 5 एमएल मध्यम (एमओपीएस ग्लूकोज 0.4%) को टीका लगाएं, और ट्यूब को रात भर (15 घंटे और 19 घंटे के बीच) 37 डिग्री सेल्सियस और 180 आरपीएम पर सेट एक हिलने वाले इनक्यूबेटर में रखें। अगले दिन, ओडी600 एनएम को मापें, और ग्लास ट्यूब (≥25 एमएल) में ताजा तापमान-समायोजित माध्यम (37 डिग्री सेल्सियस, एमओपीएस ग्लिसरॉल 0.4%) में संस्कृति को ~0.001 के अंतिम ओडी 600 एनएम तक पतला करें। 180 आरपीएम (15 घंटे और 19 घंटे के बीच) पर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में संस्कृति को रात भर बढ़ने दें। अगले दिन, ओडी600 एनएम को मापें, और संस्कृति को 0.3 के अंतिम ओडी600 एनएम तक इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेट करते समय, पहली पंक्ति (पंक्ति ए) के कुओं को छोड़कर हर कुएं में 0.01 एम एमजीएसओ4 घोल के 90 μL रखकर 96-वेल प्लेटें तैयार करें। चरण 3.7 में 96-वेल प्लेटों का उपयोग 10 गुना सीरियल कमजोर पड़ने के लिए किया जाएगा।नोट: इस प्रयोग में, दो उपभेदों (डब्ल्यूटी और एचयूपीए-एमचेरी स्ट्रेन) को सात अलग-अलग समय बिंदुओं पर तीन प्रतियों में परीक्षण किया गया था। चूंकि एक प्लेट में 12 कॉलम होते हैं, इसलिए एक प्लेट का उपयोग दो समय बिंदुओं के लिए किया जा सकता है, और इस प्रकार, कुल चार प्लेटें तैयार की गईं। 0.3 के ओडी600 एनएम पर, प्रत्येक जीवाणु संस्कृति के 200 μL को वापस लें। ये नमूने एंटीबायोटिक उपचार से पहले टी 0 (अनुपचारित) टाइमपॉइंट के अनुरूप हैं और एंटीबायोटिक उपचार से पहले सीएफयू-एमएल -1 के निर्धारण की अनुमति देते हैं। 3 मिनट के लिए 2,300 x g पर नमूने सेंट्रीफ्यूज करें। सेंट्रीफ्यूजेशन समय के दौरान, तरल संस्कृति में ओएफएक्स की वांछित एकाग्रता जोड़ें, और हिलाते समय 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करना जारी रखें।नोट: यहां, ओएफएक्स का उपयोग 5 μg.mL-1 की एकाग्रता पर किया गया था (एमआईसी के अनुरूप 83 गुना गुणा)। पिछले अध्ययन में, इस एकाग्रता का उपयोग ओएफएक्स एक्सपोजर25 के तहत दृढ़ता की घटना को चिह्नित करने के लिए किया गया था। समय / हत्या परख के लिए उपयोग की जाने वाली एंटीबायोटिक एकाग्रता एंटीबायोटिक, संस्कृति माध्यम और जीवाणु विकास की स्थिति के आधार पर भिन्न हो सकती है। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सेल पेलेट को 0.01 एम एमजीएसओ4 समाधान के 200 μL में पुन: निलंबित करें। चरण 3.5 में तैयार 96-वेल प्लेट के खाली कुएं में 100 μL रखें। पंक्ति A में कुएं के 10 μL को पंक्ति B में कुएं में स्थानांतरित करके तनुकरण करें जिसमें 0.01 M MgSO4 का 90 μL है। पंक्ति B में कुएं के 10 μL को पंक्ति C में कुएं में स्थानांतरित करके सीरियल कमजोर पड़ने को जारी रखें। 10−7 के कमजोर पड़ने तक पहुंचने तक दोहराएं (प्रत्येक स्थानांतरण 10 गुना कमजोर पड़ने के साथ)।नोट: इस प्रयोग में, छह संस्कृतियों ( डब्ल्यूटी स्ट्रेन के लिए तीन और एचयूपीए-एमचेरी स्ट्रेन के लिए तीन) का हर टाइमपॉइंट के लिए परीक्षण किया गया था। प्रोटोकॉल के अनुसार, एक ही समय में छह उपभेदों के लिए सीरियल कमजोर पड़ने के लिए एक म्यूटी-चैनल पिपेट का उपयोग किया जाता है। तकनीकी त्रुटि को कम करने के लिए, पिपेट युक्तियों को हर हस्तांतरण के बीच बदल दिया जाता है। चरण 3.1 में तैयार एलबी एगर प्लेटों पर प्रत्येक तनुकरण का 10 μL स्पॉट करें।नोट: एक बहु-चैनल पिपेट का उपयोग एक साथ छह संस्कृतियों के लिए एक ही कमजोर पड़ने (जैसे, 10-4 कमजोर पड़ने) को देखने के लिए किया जाता है। स्पॉटिंग के दौरान, मल्टी-चैनल पिपेट के पहले स्टॉप का उपयोग दूसरे स्टॉप को धक्का दिए बिना किया जाना चाहिए, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप माइक्रोड्रॉपलेट्स को प्लेट पर वितरित किया जा सकता है। एंटीबायोटिक जोड़ने के बाद प्रासंगिक समय बिंदुओं पर, संस्कृति के 200 μL को वापस लें, और चरण 3.8 में वर्णित सीरियल कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें। चरण 3.9 में वर्णित प्रत्येक कमजोर पड़ने का स्पॉट 10 μL।नोट: यहां वर्णित प्रयोग के लिए, सात समय बिंदु एकत्र किए गए थे (टी 0, टी 1 एच, टी 2 एच, टी 3 एच, टी 4 एच, टी 5 एच, टी 6 एच)। डब्ल्यूटी की तुलना में एंटीबायोटिक संवेदनशीलता में वृद्धि का प्रदर्शन करने वाले उपभेदों के लिए, अवशिष्ट एंटीबायोटिक दवाओं को हटाने के लिए एमजीएसओ4 0.01 एम में कई वॉश किए जा सकते हैं। प्लेटों को रात भर (15 घंटे और 19 घंटे के बीच) 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। अगले दिन, कॉलोनियों की संख्या को दो सबसे अधिक कमजोर पड़ने पर गिना जाए, जिनके लिए कॉलोनियों का पता लगाया जा सकता है। आदर्श रूप से, इन कमजोर पड़ने के लिए आगर प्लेटों पर धब्बे में 3 से 30 कॉलोनियां होती हैं जो प्रत्येक नमूने के लिए सीएफयू-एमएल -1 के सटीक निर्धारण की अनुमति देती हैं। प्रारंभिक जनसंख्या के सीएफयू-एमएल -1 द्वारा प्रत्येक समय बिंदु के गणना किए गए सीएफयू-एमएल -1 को टी 0 पर विभाजित करके उत्तरजीविता अनुपात की गणना करें। 4. टाइम-किल परख नोट: जबकि स्पॉट परख किसी दिए गए एंटीबायोटिक के लिए दिए गए तनाव की जीवित रहने की दर का अनुमान लगाने के लिए उपयोग में आसान तरीका है, टाइम-किल परख एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन उत्तरजीविता दर देते हैं और बैक्टीरिया की व्यवहार्यता को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए किए जाते हैं। हत्या वक्र की प्रोफ़ाइल का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि क्या कोई दिया गया जीवाणु तनाव किसी दिए गए स्थिति में एंटीबायोटिक के प्रति संवेदनशील, सहिष्णु या प्रतिरोधी है। इसके अलावा, टाइम-किल परख दृढ़ता घटना (बाइफैसिक किलिंग वक्र की दूसरी ढलान की शुरुआत) के साथ-साथ दृढ़ता आवृत्ति का पता लगाने के लिए आवश्यक एंटीबायोटिक जोखिम के समय के निर्धारण की अनुमति देता है। टाइम-किल प्लेटिंग परख के लिए एलबी एगर प्लेट्स तैयार करें। पेट्री डिश (±57 सेमी 2) में25 एमएल एलबी आगर डालें। प्रति टाइमपॉइंट कम से कम दो पेट्री व्यंजन तैयार करें (प्रति तनाव प्रति टाइमपॉइंट पर दो कमजोर पड़ने वाले व्यंजन चढ़ाए जाते हैं)। एलबी एगर को जमने दें, और प्रत्येक प्लेट में पांच से आठ बाँझ ग्लास मोती जोड़ने से पहले प्लेटों को सुखाएं। तनाव/स्थिति/टाइमपॉइंट के अनुसार प्लेटों को इनवर्ट और लेबल करें।नोट: ग्लास मोती चरण 4.7 और चरण 4.9 के दौरान आगर प्लेटों पर बैक्टीरिया के प्रसार की अनुमति देते हैं। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को स्प्रेडर का उपयोग करके आगर प्लेट पर फैलाया जा सकता है। प्रत्येक नमूने के लिए, 0.01 एमजीएसओ4 समाधान के 900 μL युक्त 10 गुना सीरियल तनुकरण ग्लास ट्यूब तैयार करें। प्रति नमूना कमजोर पड़ने वाले ग्लास ट्यूबों की संख्या जिसे तैयार करने की आवश्यकता होती है, स्पॉट परख में कॉलोनियों का पता लगाने के लिए आवश्यक कमजोर पड़ने से मेल खाती है। एक ग्लास ट्यूब (≥25 एमएल) में एक पृथक कॉलोनी के साथ 5 एमएल मध्यम (एमओपीएस ग्लूकोज 0.4%) को टीका लगाएं, और ट्यूब को रात भर (15 घंटे और 19 घंटे के बीच) 37 डिग्री सेल्सियस और 180 आरपीएम पर सेट एक हिलने वाले इनक्यूबेटर में रखें। 16 घंटे की वृद्धि के बाद, ओडी600 एनएम को मापें, और ग्लास ट्यूब में ताजा तापमान-समायोजित माध्यम (37 डिग्री सेल्सियस, एमओपीएस ग्लिसरॉल 0.4%) में संस्कृति को ~0.001 के अंतिम ओडी 600 एनएम तक पतला करें। 180 आरपीएम (15 घंटे और 19 घंटे के बीच) पर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में संस्कृति को रात भर बढ़ने दें। अगले दिन, ओडी600 एनएम को मापें, और संस्कृति को 0.3 के अंतिम ओडी600 एनएम तक इनक्यूबेट करें। 0.3 के ओडी600 एनएम पर, कल्चर के 100 μL को वापस लें, स्पॉट परख में प्राप्त आंकड़ों के अनुसार पतला करें (0.3 के OD 600 nm पर और एंटीबायोटिक के बिना, 10−5 कमजोर पड़ने से आमतौर पर 200-300 कॉलोनियां मिलती हैं), और चरण 4.1-4.2 में तैयार एलबी एगर प्लेटों पर प्लेट 100 μL। डिश किनारों से संपर्क करने वाले मोतियों से बचने के लिए प्लेटों को धीरे से हिलाएं, क्योंकि इससे एलबी एगर माध्यम पर बैक्टीरिया कोशिकाओं का गैर-समरूप प्रसार हो सकता है। एंटीबायोटिक उपचार से पहले यह पहला नमूना टी 0 समय बिंदु (एंटीबायोटिक उपचार से पहले सीएफयूएमएल -1 ) से मेल खाता है। OFX की वांछित एकाग्रता जोड़ें, और हिलाते समय 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करना जारी रखें।नोट: यहां, ओएफएक्स का उपयोग 5 μg.mL-1 की एकाग्रता पर किया गया था (एमआईसी के अनुरूप 83 गुना गुणा)। एंटीबायोटिक जोड़ने के बाद प्रासंगिक समय बिंदुओं पर, कल्चर के 100 μL को वापस लें, स्पॉट परख में प्राप्त आंकड़ों के अनुसार पतला करें, और चरण 4.1-4.2 में तैयार एलबी एगर प्लेटों पर प्लेट 100 μL। चरण 4.7 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को प्लेट करें।नोट: यहां वर्णित प्रयोग के लिए, सात समय बिंदु एकत्र किए गए थे (टी 0, टी 1 एच, टी 2 एच, टी 3 एच, टी 4 एच, टी 5 एच, टी 6 एच)। डब्ल्यूटी की तुलना में बढ़ी हुई एंटीबायोटिक संवेदनशीलता का प्रदर्शन करने वाले उपभेदों के लिए, अवशिष्ट एंटीबायोटिक दवाओं को हटाने के लिए एमजीएसओ4 0.01 एम में कई वॉश किए जा सकते हैं। प्लेटों को रात भर (15 घंटे और 19 घंटे के बीच) 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। अगले दिन, कॉलोनियों की संख्या को दो सबसे अधिक कमजोर पड़ने पर गिना जाए, जिनके लिए कॉलोनियों का पता लगाया जा सकता है। आदर्श रूप से, प्लेटों में प्रत्येक नमूने में सीएफयू-एमएल -1 के सटीक निर्धारण की अनुमति देने के लिए 30-300 कॉलोनियां होनी चाहिए। T0 पर CFU.mL-1 द्वारा प्रत्येक समय-बिंदु पर CFU.mL-1 को सामान्य करके उत्तरजीविता अनुपात की गणना करें। लॉग10 सामान्यीकृत CFU.mL-1 को समय के कार्य के रूप में प्लॉट करें। 5. माइक्रोफ्लुइडिक टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी इमेजिंग नोट: निम्नलिखित खंड माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट की तैयारी के साथ-साथ टाइम-लैप्स छवि अधिग्रहण और छवि विश्लेषण प्रक्रिया का वर्णन करता है। इस प्रयोग का उद्देश्य एकल-कोशिका स्तर पर एंटीबायोटिक उपचार पर दृढ़ता फेनोटाइप का निरीक्षण और विश्लेषण करना है। इस प्रयोग के दौरान एकत्र किए गए डेटा का उपयोग प्रयोग के दौरान संबोधित प्रश्न और / या फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के आधार पर परिणामों की एक विस्तृत श्रृंखला उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। यहां वर्णित प्रयोग में, सेल की लंबाई और एचयू-एमचेरी फ्लोरेसेंस22 का मात्रात्मक विश्लेषण, जो परसिस्टर और गैर-परसिस्टर कोशिकाओं में न्यूक्लियोइड संगठन को दर्शाता है, किया गया था। माइक्रोफ्लुइडिक टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी के लिए बैक्टीरियल सेल कल्चरएक ग्लास ट्यूब (≥25 एमएल) में एक पृथक कॉलोनी के साथ मध्यम (एमओपीएस ग्लिसरॉल 0.4%, यदि आवश्यक हो तो चयनात्मक एंटीबायोटिक के साथ पूरक) का टीका लगाएं, और ट्यूब को रात भर (15 घंटे और 19 घंटे के बीच) 37 डिग्री सेल्सियस और 180 आरपीएम पर सेट एक हिलने वाले इनक्यूबेटर में रखें। अगले दिन, ओडी600 एनएम को मापें, और कांच की ट्यूब में ताजा तापमान-समायोजित माध्यम (37 डिग्री सेल्सियस, एमओपीएस ग्लिसरॉल 0.4%) में संस्कृति को ~0.001 के अंतिम ओडी 600 एनएम तक पतला करें। अगले दिन प्रारंभिक घातीय-चरण संस्कृति प्राप्त करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 180 आरपीएम पर एक हिलने वाले इनक्यूबेटर में संस्कृति को रात भर (15 घंटे और 19 घंटे के बीच) बढ़ने दें। माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट और टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी इमेजिंग की तैयारीनोट: माइक्रोफ्लुइडिक प्रयोगों को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों (जैसा कि यहां वर्णित है) या इन-हाउस उत्पादित माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम में किया जा सकता है।माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट के हर कुएं से संरक्षण समाधान (यदि मौजूद है) को हटा दें, और इसे एक ताजा संस्कृति माध्यम के साथ बदलें।नोट: यदि माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट में एक अपशिष्ट आउटलेट अच्छी तरह से होता है, तो आउटलेट वेल के संरक्षण समाधान को हटा दिया जाना चाहिए लेकिन माध्यम द्वारा प्रतिस्थापित नहीं किया जाना चाहिए। सील बटन पर क्लिक करके या माइक्रोफ्लुइडिक सॉफ्टवेयर के माध्यम से कई गुना सिस्टम के साथ माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट को सील करें (पहले टूल का चयन करें, उसके बाद सील प्लेट)।नोट: प्लेट को सील करने के लिए, प्लेट पर एक समान दबाव लागू किया जाना चाहिए और प्लेट को कई गुना के खिलाफ मैन्युअल रूप से निचोड़कर कई गुना। यदि सही तरीके से प्रदर्शन किया जाता है, तो नोट “सील” ONIX2 इंटरफ़ेस पर दिखाई देना चाहिए। कई गुना टूटने के किसी भी संभावित जोखिम से बचने के लिए ग्लास स्लाइड पर कोई दबाव लागू नहीं करना महत्वपूर्ण है। एक बार सील होने के बाद, पहला प्राइमिंग अनुक्रम निष्पादित करें (माइक्रोफ्लुइडिक सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस पर रन लिक्विड प्राइमिंग सीक्वेंस पर क्लिक करें)।नोट: रन लिक्विड प्राइमिंग अनुक्रम कुएं 1-5 के लिए 6.9 केपीए पर छिड़काव के 5 मिनट से मेल खाता है, इसके बाद कुएं 8 के लिए 6.9 केपीए पर छिड़काव के 5 मिनट से मेल खाता है, और 6.9 केपीए पर 5 मिनट के लिए अच्छी तरह से 6 के लिए अंतिम छिड़काव राउंड होता है। रन लिक्विड प्राइमिंग सीक्वेंस संरक्षण समाधान को हटाने की अनुमति देता है जो अभी भी विभिन्न कुओं को जोड़ने वाले चैनलों में मौजूद हो सकता है। माइक्रोस्कोपी इमेजिंग की शुरुआत से पहले न्यूनतम 2 घंटे के लिए वांछित तापमान (यहां, 37 डिग्री सेल्सियस) पर माइक्रोस्कोप के थर्मोस्टेटिक रूप से नियंत्रित कैबिनेट में प्लेट को इनक्यूबेट करें। प्रयोग शुरू करने से पहले एक दूसरा रन लिक्विड प्राइमिंग सीक्वेंस शुरू करें। माइक्रोफ्लुइडिक सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस पर सील ऑफ पर क्लिक करके माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट को सील करें। कुएं 1 और कुएं 2 में माध्यम को 200 μL ताजा माध्यम के साथ बदलें, अच्छी तरह से 3 में एंटीबायोटिक युक्त 200 μL ताजा माध्यम के साथ (यहां, OFX 5 μ mL−1 पर), कुएं 4 और कुएं 5 में 200 μL ताजा माध्यम के साथ, कुएं 6 में 200 μL ताजा माध्यम के साथ, और अच्छी तरह से 8 में 200 μL संस्कृति नमूने के साथ (चरण 5.1.2 से) पतला करके600 nm तक पतला किया गया ताजा माध्यम में 0.01 की वृद्धि। चरण 5.2.2 में वर्णित माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट को सील करें, और प्लेट को माइक्रोस्कोप कैबिनेट के अंदर माइक्रोस्कोप उद्देश्य पर रखें।नोट: माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट रखने से पहले माइक्रोस्कोप उद्देश्य पर विसर्जन तेल की एक बूंद रखना सुनिश्चित करें। माइक्रोफ्लुइडिक सॉफ्टवेयर में, सेल लोडिंग पर क्लिक करें ताकि सेल को माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट में ले जाने की अनुमति मिल सके।नोट: सेल लोडिंग चरण में कुएं 8 के लिए 13.8 केपीए पर छिड़काव के 15 एस शामिल हैं, इसके बाद वेल 6 और वेल 8 के लिए 27.6 केपीए पर 15 एस छिड़काव शामिल है, और 6.9 केपीए पर 30 सेकंड के लिए वेल 6 के लिए अंतिम छिड़काव राउंड है। प्रयोग के लिए माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट में कोशिकाओं का घनत्व महत्वपूर्ण है। इस माइक्रोफ्लुइडिक प्रोटोकॉल के पहले भाग में एंटीबायोटिक उपचार से पहले एक ताजा माध्यम में 6 घंटे के लिए बढ़ते बैक्टीरिया होते हैं। विकास के 6 घंटे के बाद, सेल घनत्व दुर्लभ परसिस्टर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए पर्याप्त होना चाहिए (इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली स्थितियों में, परसिस्टर कोशिकाएं 10−4 की आवृत्ति पर उत्पन्न होती हैं)। यदि सेल घनत्व बहुत अधिक है, तो व्यक्तिगत कोशिकाओं को अलग करना मुश्किल है, जो सटीक एकल-कोशिका विश्लेषण को रोकता है। चूंकि विकास दर सीधे माध्यम पर निर्भर है, प्रयोग शुरू करने से पहले माइक्रोस्कोपी क्षेत्रों में कोशिकाओं के घनत्व का आकलन किया जाना चाहिए। संचारित प्रकाश मोड का उपयोग करके एक इष्टतम फोकस सेट करें, और रुचि के कई क्षेत्रों (आरओआई) का चयन करें जहां एक उपयुक्त सेल संख्या देखी जाती है (प्रति क्षेत्र 300 कोशिकाओं तक)।नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 40 ROIs का चयन करें कि दुर्लभ परसिस्टर कोशिकाओं को चित्रित किया गया है। माइक्रोफ्लुइडिक सॉफ़्टवेयर पर, प्रोटोकॉल बनाएँ पर क्लिक करें। 6 घंटे (अच्छी तरह से 1-2) के लिए 6.9 केपीए पर ताजा माध्यम के इंजेक्शन को प्रोग्राम करें, इसके बाद 6 घंटे (अच्छी तरह से 3) के लिए 6.9 केपीए पर एंटीबायोटिक युक्त माध्यम का इंजेक्शन, और अंत में, 20 घंटे (कुएं 4-5) के लिए 6.9 केपीए पर ताजा माध्यम का इंजेक्शन।नोट:0.01 के ओडी 600 एनएम तक पतला एक जीवाणु संस्कृति बैक्टीरिया को 6 घंटे के लिए माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष में बढ़ने की अनुमति देती है, यह सुनिश्चित करती है कि कोशिकाएं घातीय विकास चरण में हैं। लोडिंग चरण के दौरान माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में पेश की गई कोशिकाओं की संख्या के आधार पर (चरण 5.2.8 देखें), विकास चरण की अवधि को प्रति आरओआई 300 कोशिकाओं तक प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। जैसा कि दृढ़ता एक दुर्लभ घटना है, प्रति आरओआई कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि से परसिस्टर कोशिकाओं को देखने की संभावना में सुधार होता है। सेल संख्या, हालांकि, प्रति आरओआई 300 कोशिकाओं से अधिक नहीं होनी चाहिए, क्योंकि यह एकल-सेल विश्लेषण को थकाऊ बनाता है। फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के लिए संचारित प्रकाश और उत्तेजना प्रकाश स्रोत का उपयोग करके हर 15 मिनट में एक फ्रेम के साथ टाइम-लैप्स मोड में माइक्रोस्कोपी इमेजिंग करें। यहां, एमचेरी सिग्नल के लिए 560 एनएम उत्तेजना प्रकाश स्रोत का उपयोग किया गया था (फिल्टर 00 के साथ 10% शक्ति पर 580 एनएम एलईडी [530-585 एक्स, 615 एलपी एम, ज़ीस] और एमचेरी के लिए 100 एमएस एक्सपोजर)। Zeiss-संगत Zen3.2 सॉफ्टवेयर का उपयोग सेल इमेजिंग के लिए किया गया था। छवि विश्लेषणनोट: माइक्रोस्कोपी छवियों का उद्घाटन और विज़ुअलाइज़ेशन ओपन-सोर्स इमेजजे / फिजी सॉफ्टवेयर (https://fiji.sc/)26 के साथ किया जाता है। फिजी सॉफ्टवेयर और मुफ्त माइक्रोबजे प्लगइन (https://microbej.com)27 का उपयोग करके मात्रात्मक छवि विश्लेषण किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में, MicrobeJ 5.13I(14) संस्करण का उपयोग किया गया था।कंप्यूटर पर ImageJ / Fiji सॉफ़्टवेयर खोलें, और फिजी लोडिंग बार में हाइपरस्टैक टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी छवियों को खींचें। हाइपरस्टैक के विभिन्न चैनलों को फ्यूज करने के लिए छवि > रंग > समग्र बनाएं का उपयोग करें। यदि टाइम-लैप्स प्रयोग के चैनल वांछित रंग के अनुरूप नहीं हैं (उदाहरण के लिए, चरण कंट्रास्ट ग्रे के बजाय लाल रंग में दिखाया गया है), तो चैनलों पर उपयुक्त रंग लागू करने के लिए छवि > रंग > व्यवस्थित चैनलों का उपयोग करें। MicrobeJ प्लगइन खोलें, और मैन्युअल संपादन इंटरफ़ेस का उपयोग करके जीवाणु कोशिकाओं का पता लगाएं। स्वचालित रूप से पता लगाए गए कक्षों को हटाएँ, और मैन्युअल रूप से फ्रेम द्वारा रुचि फ़्रेम के परसिस्टर कक्षों को रेखांकित करें.नोट: अलग-अलग कोशिकाओं का स्वचालित रूप से पता लगाने के लिए विभिन्न सेटिंग्स का उपयोग किया जा सकता है। मैनुअल डिटेक्शन का उपयोग यहां किया गया था क्योंकि विश्लेषण किए गए परसिस्टर कोशिकाएं लंबे फिलामेंट्स बनाती हैं, जिन्हें स्वचालित पहचान का उपयोग करके शायद ही कभी सही ढंग से पता लगाया जाता है। पता लगाने के बाद, एक परिणामजे तालिका उत्पन्न करने के लिए MicrobeJ मैन्युअल संपादन इंटरफ़ेस में परिणाम आइकन का उपयोग करें। परिणामजे फ़ाइल सहेजें, और एकल-सेल विश्लेषण के रुचि के विभिन्न मापदंडों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए परिणामजे तालिका का उपयोग करें। इस प्रोटोकॉल के मामले में, एचयू-एमचेरी तीव्रता, सेल की लंबाई और व्यक्तिगत कोशिकाओं के सेल क्षेत्र की औसत प्रतिदीप्ति निर्यात की गई थी।