OBS: Använd sterilt kulturglas, pipettspetsar och tillväxtmedium. Här odlades E. coli-celler i ett kemiskt definierat medium med låg autofluorescens (se materialtabell). Inokuleringar utfördes i närvaro av en Bunsen-brännare för att minimera risken för kontaminering. 1. Cellodling och tillväxtkurva Stryk den intressanta stammen från en fryst glycerolstam på en Luria-Bertaini (LB) agarplatta (kompletterad med ett selektivt antibiotikum, om så krävs) och inkubera vid 37 °C över natten (mellan 15 och 19 timmar) för att erhålla enstaka kolonier.OBS: Experimentet som presenteras här använder två stammar, E. coli K-12 MG1655 motsvarande wt-stammen och den isogena MG1655 hupA-mCherry-stammen 22. Den senare stammen uttrycker den fluorescensmärkta α-underenheten i HU-nukleoidassocierat protein. hupA-mCherry-reportern är integrerad på hupA: s ursprungliga plats. HU-mCherry fungerar som en proxy för att följa nukleoiddynamiken i levande celler när den binder till DNA på ett icke-specifikt sätt. Inokulera 5 ml medium (här, 3-[N-morfolino] propansulfonsyrabaserat medium [MOPS]; Tabell 1, tabell 2 och tabell 3) kompletterat med glukos 0,4 % och ett selektivt antibiotikum (om så krävs) med en isolerad koloni i ett glasrör (≥25 ml) och placera röret i en skakinkubator inställd på 37 °C och 180 varv per minut (rpm) över natten (mellan 15 timmar och 19 timmar). Alternativt kan plaströr, glas eller plastkolvar (≥ 25 ml) användas istället för glasrör.OBS: MOPS-medium kompletterat med glycerol vid en slutlig koncentration av 0,4% användes under de experiment som beskrivs i detta papper, förutom de nattkulturer som utfördes i MOPS glukos 0,4%. Generationstiden för E. coli i MOPS kompletterad med glukos är kortare än i MOPS glycerol. Användning av MOPS glukos 0,4% istället för MOPS glycerol 0,4% vid detta steg säkerställer att cellerna når den stationära fasen inom 19 timmar. Andra tillväxtmedier, såsom M9 eller rich defined medium (RDM) kompletterat med distinkta kolkällor, kan också användas. Det bör dock noteras att tillväxthastigheten och persistensfrekvensen är olika beroende på vilket medium och/eller kol som används23. Följande morgon, centrifugera 1 ml kultur vid 2 300 x g i 3 minuter, kassera supernatanten och återsuspendera försiktigt pelleten i samma volym fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Mät den optiska densiteten vid 600 nm (OD 600 nm) och beräkna den volym som behövs för en initial OD600 nm på 0,01 i en slutlig volym på 2 ml. Placera 2 ml MOPS glycerol 0,4% medium i en brunn med en klar botten 24-brunnsplatta och inokulera med den beräknade odlingsvolymen över natten. Placera plattan med 24 brunnar i en automatisk mikroplattläsare (se Materialförteckning) för att övervaka OD600 nm i 24 timmar. Ställ in mikroplattläsaren på att mäta OD600 nm var 15:e minut vid en temperatur på 37 °C och med hög omloppsbana (140 rpm).OBS: Om stammen som används i experimentet kodar för en fluorescerande reporter, se till att dess tillväxthastighet är jämförbar med den för wt för att undvika artefakt i de efterföljande experimenten, eftersom tillväxthastigheten påverkar antibiotikapersistensfrekvensen23. På grund av detektionsbegränsningar vid mycket låga celldensiteter och de potentiella töjningsspecifika effekterna på förhållandet OD600 nm/colony forming units (CFU), rekommenderas att tillväxtkinetiken utvärderas genom övervakning av CFU·ml-1 vid arbete med okarakteriserade stammar. 2. Bestämning av den minsta hämmande koncentrationen av antibiotika OBS: Den minsta hämmande koncentrationen (MIC) definieras som den lägsta dosen av antibiotikum vid vilken ingen bakterietillväxt observeras. Bestämningen av MIC måste utföras för varje antibiotikum och stam. I de experiment som beskrivs här användes fluorokinolonantibiotikumet ofloxacin (OFX). Bestämningen av MIC möjliggör bekräftelse på att antibiotikumlösningen har framställts korrekt, antibiotikumet är aktivt och stammarna är lika känsliga för antibiotikumet. Här utfördes den publicerade agarutspädningsmetoden för att bestämma MIC till OFX för de olika stammarna som användes24. MIC för ett givet antibiotikum till en given bakteriestam kan också bestämmas via buljongutspädningsmetoden24. Beredning av plattorna för MIC-bestämningFörbered en stamlösning för antibiotikumet som används i experimenten genom att lösa 5 mg OFX i 1 ml ultrarent vatten. Tillsätt 20 μL 37% HCl för att öka lösligheten av OFX. Smält 100 ml steril LB-agar och håll den vid 55 °C för att undvika stelning. Bered sex små glasflaskor (25 ml) och pipettera 5 ml flytande LB-agarmedium i varje kolv med en steril pipett. Späd 10 μl av stamlösningen 5 mg·ml-1 OFX i 90 μl ultrarent vatten (spädning av stamstocken 1:10). Tillsätt 0 μl, 2 μl, 4 μl, 6 μl, 8 μl eller 10 μl av 500 μg·ml-1 OFX-lösningen till var och en av de sex glasflaskorna innehållande 5 ml LB-agarmedium för att generera LB-agarmedium med slutliga koncentrationer på 0 μg·ml−1, 0,02 μg·ml−1, 0,04 μg·ml−1, 0,06 μg·ml−1, 0,08 μg·ml−1 respektive 0,1 μg·ml-1 OFX. Blanda lösningen genom att rotera kolvarna flera gånger.OBS: Om MIC för antibiotikumet av intresse är känt, bör koncentrationsintervallet nå underifrån till över den faktiska MIC. Om MIC är okänd rekommenderas ett stort koncentrationsintervall med en log 2-spädningsserie. Se till att LB-agarmediet har svalnat innan du tillsätter antibiotikumet, eftersom höga temperaturer kan inaktivera det. Det är dock viktigt att inte låta LB-agarmediet stelna innan antibiotikan tillsätts, eftersom detta kan leda till en icke-homogen fördelning av antibiotikumet i LB-agarmediet. Häll 5 ml av vart och ett av de sex LB-agarmedierna som beretts i steg 2.1.3 på ett dosökningssätt i en 6-brunns odlingsplatta med en steril pipett. Låt agarn svalna tills den stelnat och torka plattan innan den används.OBS: Förbered antibiotikalösningen och odlingsplattan den dag analysen utförs. MIC-bestämningInokulera 5 ml LB-medium med en isolerad koloni i ett glasrör (≥25 ml) och placera glasröret i en skakinkubator inställd på 37 °C och 180 rpm över natten (mellan 15 timmar och 19 timmar). Följande morgon mäts OD600 nm och späds kulturen i ett provrör till en slutlig celldensitet på 1 x 107 CFU·ml-1 i PBS. För de stammar som testats här motsvarar 1 x 107 CFU·ml−1 en OD600 nm på 0,0125.Anmärkning: Om korrelationen mellan CFUml-1 och OD 600 nm inte är känd, bör tillväxtkurvan bestämd genom mätningar av CFU och OD 600 nm fastställas för att beräkna korrelationsfaktorn mellan CFU·ml-1 och OD 600 nm. Placera 2 μL av den tidigare utspädda kulturen på varje brunn på den torkade 6-brunnsplattan. Låt fläckarna torka innan plattan placeras i en inkubator vid 37 °C över natten (mellan 15 och 19 timmar). Nästa dag räknar du kolonierna som bildas i varje brunn. MIC motsvarar brunnen med minsta koncentration av antibiotikum där ingen bakterietillväxt detekteras. 3. Spot analys OBS: Spotanalysmetoden är ett kvalitativt tillvägagångssätt som möjliggör uppskattning av antalet livskraftiga celler (celler som kan generera kolonier efter antibiotikastress). Spottestet utförs före time-kill-testet för att ge insikter om viabiliteten hos den stam som används under de testade förhållandena och för att informera om de utspädningar som behövs under time-kill-testet (se avsnitt 4). För att förbereda LB-agarplattorna för punktanalyser, häll 50 ml LB-agar i en fyrkantig petriskål (144 cm2). Förbered en kvadratisk petriskål per tidpunkt. Låt LB-agarn stelna och torka plattorna före användning. Inokulera 5 ml medium (MOPS glukos 0,4%) med en isolerad koloni i ett glasrör (≥25 ml) och placera röret i en skakande inkubator inställd på 37 ° C och 180 rpm över natten (mellan 15 timmar och 19 timmar). Nästa dag mäts OD 600 nm och späds kulturen till färskt temperaturjusterat medium (37 °C, MOPS-glycerol 0,4%) i ett glasrör (≥25 ml) till en slutlig OD600 nm på ~0,001 . Låt kulturen växa över natten i en inkubator vid 37 °C vid 180 rpm (mellan 15 och 19 timmar). Mät OD 600 nm följande dag och inkubera kulturen till en slutlig OD600 nm på 0,3. Bered under inkubation plattor med 96 brunnar genom att placera 90 μl 0,01 MMgSO4-lösning i varje brunn utom brunnarna i första raden (rad A). Plattorna med 96 brunnar kommer att användas för 10-faldig serieutspädning i steg 3.7.OBS: I detta experiment testades två stammar (wt och hupA-mCherry-stammen ) i tre exemplar vid sju olika tidpunkter. Eftersom en platta består av 12 kolonner kan en platta användas för två tidpunkter, och därmed framställdes totalt fyra plattor. Dra ut 200 μl av varje bakteriekultur vid en OD600 nm på 0,3. Dessa prover motsvarar t0 (obehandlad) tidpunkt före antibiotikabehandlingen och möjliggör bestämning av CFU·ml-1 före antibiotikabehandling. Centrifugera proverna vid 2 300 x g i 3 minuter. Tillsätt önskad koncentration av OFX till vätskekulturen under centrifugeringstiden och fortsätt att inkubera vid 37 °C under skakning.OBS: Här användes OFX i en koncentration av 5 μg·ml-1 (motsvarande MIC multiplicerat 83-faldigt). I en tidigare studie användes denna koncentration för att karakterisera persistensfenomenet under OFX-exponering25. Den antibiotikakoncentration som används för tid / dödanalyser kan variera beroende på antibiotika, odlingsmedium och tillståndet för bakterietillväxt. Efter centrifugering suspenderas cellpelleten igen i 200 μl 0,01 MMgSO4-lösning . Placera 100 μl i den tomma brunnen på den platta med 96 brunnar som beretts i steg 3.5. Utför en utspädning genom att överföra 10 μL av brunnen i rad A till brunnen i rad B innehållande 90 μL 0,01 MMgSO4. Fortsätt serieutspädningarna genom att överföra 10 μl av brunnen i rad B till brunnen i rad C. Upprepa tills en utspädning på 10−7 uppnås (där varje överföring är en 10-faldig utspädning).OBS: I detta experiment testades sex kulturer (tre för wt-stammen och tre för hupA-mCherry-stammen ) för varje tidpunkt. Enligt protokollet används en mutikanalpipett för att utföra serieutspädningarna för de sex stammarna samtidigt. För att minimera det tekniska felet byts pipettspetsarna mellan varje överföring. Placera 10 μl av varje spädning på LB-agarplattorna som beretts i steg 3.1.OBS: En flerkanalig pipett används för att samtidigt upptäcka samma utspädning (t.ex. en 10−4 utspädning) för de sex kulturerna. Under spottningen bör det första stoppet på flerkanalspipetten användas utan att trycka på det andra stoppet, eftersom detta kan resultera i att mikrodroppar dispenseras på plattan. Dra upp 200 μl av kulturen vid relevanta tidpunkter efter tillsatsen av antibiotika och utför serieutspädningar enligt beskrivningen i steg 3.8. Spot 10 μL av varje spädning enligt beskrivningen i steg 3.9.OBS: För experimentet som beskrivs här samlades sju tidpunkter (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). För stammar som uppvisar ökad antibiotikakänslighet jämfört med WT kan flera tvättar i MgSO4 0,01 M utföras för att avlägsna kvarvarande antibiotika. Inkubera plattorna vid 37 °C över natten (mellan 15 och 19 timmar). Nästa dag, räkna antalet kolonier vid de två högsta utspädningarna för vilka kolonier kan detekteras. Idealt sett innehåller fläckarna på agarplattorna för dessa utspädningar mellan 3 och 30 kolonier som möjliggör noggrann bestämning av CFU·ml-1 för varje prov. Beräkna överlevnadskvoten genom att dividera den beräknade CFU·ml-1 för varje tidpunkt med CFU·ml-1 för den ursprungliga populationen vid t0. 4. Time-kill-analyser OBS: Medan punktanalyser är en lättanvänd metod för att uppskatta överlevnadshastigheten för en given stam för ett givet antibiotikum, ger tidsdödande analyser en överlevnadshastighet med högre upplösning och utförs för att exakt kvantifiera bakteriell livskraft. Profilen för dödskurvan kan användas för att bestämma om en given bakteriestam är känslig, tolerant eller resistent mot antibiotikumet i ett givet tillstånd. Dessutom möjliggör tidsdödande analyser bestämning av den tid för antibiotikaexponering som behövs för att detektera persistensfenomenet (början av den andra lutningen i den bifasiska dödskurvan) samt persistensfrekvensen. Förbered LB-agarplattor för time-kill plating-analysen. Häll 25 ml LB-agar i en petriskål (±57 cm2). Förbered minst två petriskålar per tidpunkt (två utspädningar per tidpunkt per stam är pläterade). Låt LB-agarn stelna och torka plattorna innan du lägger till fem till åtta sterila glaspärlor på varje platta. Invertera och märk plattorna enligt stam / tillstånd / tidpunkt.OBS: Glaspärlor tillåter spridning av bakterier på agarplattorna under steg 4.7 och steg 4.9. Alternativt kan cellerna dispergeras på agarplattan med hjälp av en spridare. Bered 10-faldiga glasrör i serieutspädning som innehåller 900 μl 0,01 MMgSO4-lösning för varje prov. Det antal utspädningsglasrör per prov som behöver beredas motsvarar de utspädningar som behövs för att påvisa kolonier i punkttestet. Inokulera 5 ml medium (MOPS glukos 0,4%) med en isolerad koloni i ett glasrör (≥25 ml) och placera röret i en skakande inkubator inställd på 37 ° C och 180 rpm över natten (mellan 15 timmar och 19 timmar). Efter 16 timmars tillväxt mäts OD 600 nm och späd kulturen till ett färskt temperaturjusterat medium (37 °C, MOPS-glycerol 0,4 %) i ett glasrör till en slutlig OD600 nm på ~0,001 . Låt kulturen växa över natten i en inkubator vid 37 °C vid 180 rpm (mellan 15 och 19 timmar). Mät OD 600 nm följande dag och inkubera kulturen till en slutlig OD600 nm på 0,3. Vid en OD 600 nm på 0,3 dras 100 μl av kulturen ut, späds enligt de data som erhållits i spotanalysen (vid en OD600 nm av 0,3 och utan antibiotika ger en 10−5 spädning vanligen 200-300 kolonier) och platta100 μL på LB-agarplattorna beredda i steg 4.1-4.2. Skaka försiktigt plattorna för att undvika att pärlorna kommer i kontakt med skålkanterna, eftersom detta kan leda till en icke-homogen spridning av bakteriecellerna på LB-agarmediet. Detta första prov före antibiotikabehandlingen motsvarar t0-tidpunkten (CFU·ml-1 före antibiotikabehandling). Tillsätt önskad koncentration av OFX och fortsätt inkubera vid 37 °C under skakning.OBS: Här användes OFX i en koncentration av 5 μg·ml-1 (motsvarande MIC multiplicerat 83-faldigt). Vid relevanta tidpunkter efter tillsatsen av antibiotikumet dras 100 μl av kulturen ut, späds ut enligt de data som erhållits i punkttestet och plattan 100 μl på LB-agarplattorna som beretts i steg 4.1–4.2. Platta cellerna enligt beskrivningen i steg 4.7.OBS: För experimentet som beskrivs här samlades sju tidpunkter (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). För stammar som uppvisar en ökad antibiotikakänslighet jämfört med vikten, kan flera tvättar i MgSO4 0,01 M utföras för att avlägsna kvarvarande antibiotika. Inkubera plattorna vid 37 °C över natten (mellan 15 och 19 timmar). Nästa dag, räkna antalet kolonier vid de två högsta utspädningarna för vilka kolonier kan detekteras. Helst bör plattorna innehålla 30-300 kolonier för att möjliggöra en noggrann bestämning av CFU · ml-1 i varje prov. Beräkna överlevnadskvoten genom att normalisera CFU·ml-1 vid varje tidpunkt med CFU·ml-1 vid t0. Plotta loggen10 normaliserad CFU·mL-1 som en funktion av tiden. 5. Mikrofluidisk time-lapse-mikroskopiavbildning OBS: I följande avsnitt beskrivs förberedelsen av mikrofluidikplattan samt tidsfördröjningsbildtagning och bildanalysprocedur. Syftet med detta experiment är att observera och analysera persistensfenotypen vid antibiotikabehandling på encellsnivå. De data som samlats in under detta experiment kan användas för att generera ett brett spektrum av resultat beroende på vilken fråga som behandlas och / eller de fluorescerande reportrarna som används under experimentet. I experimentet som beskrivs här utfördes kvantitativ analys av celllängden och HU-mCherry-fluorescens22, vilket återspeglar nukleoidorganisationen i persister- och icke-persisterceller. Bakteriell cellodling för mikrofluidisk time-lapse-mikroskopiInokulera 5 ml medium (MOPS glycerol 0,4%, kompletterat med ett selektivt antibiotikum om det behövs) med en isolerad koloni i ett glasrör (≥25 ml) och placera röret i en skakinkubator inställd på 37 ° C och 180 rpm över natten (mellan 15 timmar och 19 timmar). Nästa dag mäts OD 600 nm och späds kulturen i färskt temperaturjusterat medium (37 °C, MOPS glycerol 0,4%) i ett glasrör till en slutlig OD600 nm på ~0,001 . Låt kulturen växa över natten (mellan 15 och 19 timmar) i en skakinkubator vid 37 °C och 180 rpm för att få en tidig exponentiell faskultur nästa dag. Beredning av mikrofluidisk platta och time-lapse mikroskopi avbildningOBS: Mikrofluidiska experiment kan utföras i kommersiellt tillgängliga mikrofluidiska enheter (som beskrivs här) eller i internt producerade mikrofluidiska system.Ta bort konserveringslösningen (om sådan finns) från varje brunn på mikrofluidplattan och ersätt den med ett nytt odlingsmedium.OBS: Om mikrofluidikplattan innehåller en avfallsutloppsbrunn ska konserveringslösningen av utloppsbrunnen avlägsnas men inte ersättas av mediet. Försegla mikrofluidikplattan med grenrörssystemet genom att klicka på tätningsknappen eller genom mikrofluidikprogramvaran (välj först Verktyg, följt av Tätningsplatta).OBS: För att täta plattan bör ett jämnt tryck appliceras på plattan och grenröret genom att manuellt pressa plattan mot grenröret. Om det utförs korrekt ska anteckningen “förseglad” visas på ONIX2-gränssnittet. Det är viktigt att inte applicera något tryck på glasskivan för att undvika eventuell risk att bryta grenröret. När den är förseglad, utför en första primingsekvens (klicka på Kör flytande primingsekvens på mikrofluidikprogramvarugränssnittet).OBS: Run Liquid Priming Sequence motsvarar 5 min perfusion vid 6,9 kPa för brunnarna 1-5, följt av 5 min perfusion vid 6,9 kPa för brunn 8 och en slutlig perfusionsomgång för brunn 6 i 5 min vid 6,9 kPa. Run Liquid Priming Sequence gör det möjligt att avlägsna den bevarandelösning som fortfarande kan finnas i kanalerna som förbinder de olika brunnarna. Inkubera plattan i ett termostatstyrt skåp i mikroskopet vid önskad temperatur (här 37 °C) i minst 2 timmar innan mikroskopiavbildningen påbörjas. Starta en andra Run Liquid Priming Sequence innan du påbörjar experimentet. Försegla mikrofluidikplattan genom att klicka på Seal off på microfluidic software interface. Byt ut mediet i brunn 1 och brunn 2 med 200 μl färskt medium, i brunn 3 med 200 μl färskt medium innehållande antibiotikumet (här OFX vid 5 μg·ml−1), i brunn 4 och brunn 5 med 200 μl färskt medium, i brunn 6 med 200 μl färskt medium och i brunn 8 med 200 μl av odlingsprovet (från steg 5.1.2) utspätt till en OD600 nm på 0,01 i färskt medium. Försegla mikrofluidplattan enligt beskrivningen i steg 5.2.2 och placera plattan på mikroskopmålet inuti mikroskopskåpet.OBS: Se till att placera en droppe nedsänkningsolja på mikroskopmålet innan du placerar mikrofluidplattan. I mikrofluidikprogramvaran klickar du på Cellladdning för att tillåta cellladdning i mikrofluidplattan.OBS: Cellladdningssteget omfattar 15 s perfusion vid 13,8 kPa för brunn 8, följt av 15 s perfusion vid 27,6 kPa för brunn 6 och brunn 8, och en slutlig perfusionsomgång för brunn 6 för 30 s vid 6,9 kPa. Tätheten av cellerna i mikrofluidikplattan är avgörande för experimentet. Den första delen av detta mikrofluidiska protokoll består av att odla bakterier i 6 timmar i ett nytt medium före antibiotikabehandlingen. Efter 6 timmars tillväxt måste celldensiteten vara tillräcklig för att detektera de sällsynta persistercellerna (under de förhållanden som används i denna studie genererar persistercellerna med en frekvens av 10−4). Om celldensiteten är för hög är det svårt att skilja de enskilda cellerna, vilket förhindrar exakt encellsanalys. Eftersom tillväxthastigheten är direkt beroende av mediet bör tätheten av celler i mikroskopifälten bedömas innan experimentet inleds. Ställ in ett optimalt fokus med överfört ljusläge och välj flera intressanta regioner (ROI) där ett lämpligt cellnummer observeras (upp till 300 celler per fält).Välj minst 40 ROI för att se till att de sällsynta persistercellerna avbildas. På mikrofluidikprogramvaran klickar du på Skapa ett protokoll. Programmera injektionen av färskt medium vid 6,9 kPa i 6 h (brunn 1-2), följt av injektion av mediet innehållande antibiotikumet vid 6,9 kPa i 6 h (brunn 3) och slutligen injektion av färskt medium vid 6,9 kPa i 20 h (brunnar 4-5).OBS: En bakteriekultur utspädd till en OD600 nm på 0,01 tillåter bakterier att växa i mikrofluidikkammaren i 6 timmar, vilket säkerställer att cellerna befinner sig i exponentiell tillväxtfas. Beroende på antalet celler som förs in i den mikrofluidiska anordningen under laddningssteget (se steg 5.2.8) kan tillväxtfasens varaktighet anpassas för att erhålla upp till 300 celler per ROI. Eftersom persistens är ett sällsynt fenomen förbättrar ökningen av antalet celler per ROI möjligheten att observera persisterande celler. Cellantalet bör dock inte överstiga 300 celler per ROI, eftersom detta gör encellsanalys tråkig. Utför mikroskopiavbildning i time-lapse-läge med en bild var 15: e minut med överfört ljus och excitationsljuskällan för den fluorescerande reportern. Här användes en 560 nm excitationsljuskälla för mCherry-signalen (580 nm LED vid 10% effekt med filter 00 [530-585 ex, 615LP em, Zeiss] och 100 ms exponering för mCherry). Den Zeiss-kompatibla Zen3.2-programvaran användes för cellavbildning. BildanalysOBS: Öppningen och visualiseringen av mikroskopibilderna utförs med ImageJ / Fiji-programvaran med öppen källkod (https://fiji.sc/)26. Den kvantitativa bildanalysen utförs med hjälp av programvaran ImageJ/Fiji med öppen källkod och det kostnadsfria MicrobeJ-plugin-programmet (https://microbej.com)27. I detta protokoll användes MicrobeJ 5.13I (14) -versionen.Öppna ImageJ / Fiji-programvaran på datorn och dra hyperstack-time-lapse-mikroskopibilderna till Fiji-laddningsfältet. Använd Image > Color > Make Composite för att smälta samman de olika kanalerna i hyperstacken. Om kanalerna i tidsfördröjningsexperimentet inte motsvarar den önskade färgen (t.ex. om faskontrasten visas i rött istället för grått) använder du Bild > Färg > Ordna kanaler för att tillämpa rätt färg på kanalerna. Öppna MicrobeJ-plugin och upptäck bakteriecellerna med hjälp av det manuella redigeringsgränssnittet. Ta bort de automatiskt identifierade cellerna och skapa en ikon för de bevarade cellerna av intresse manuellt ram för bildruta.Olika inställningar kan användas för att automatiskt upptäcka enskilda celler. Manuell detektion användes här eftersom de analyserade persistercellerna bildar långa filament, som sällan detekteras korrekt med automatisk detektering. Efter identifieringen använder du ikonen Resultat i MicrobeJ manuella redigeringsgränssnitt för att generera en ResultJ-tabell. Spara ResultJ-filen och använd ResultJ-tabellen för att få insikter i olika parametrar av intresse för encellsanalysen. I detta protokolls fall exporterades medelfluorescensen för HU-mCherry-intensiteten, celllängden och cellarean för enskilda celler.