Kontroll av partikelfraktion i mikroporösa glödgade partikelställningar för 3D-cellodling
Summary
Att minimera variationen i partikelfraktionen inom granulära byggnadsställningar underlättar reproducerbara experiment. Detta arbete beskriver metoder för att generera granulära byggnadsställningar med kontrollerade partikelfraktioner för in vitro-vävnadstekniska applikationer.
Abstract
Mikrogeler är byggstenarna i mikroporösa glödgade partikelställningar (MAP), som fungerar som en plattform för både in vitro-cellodling och vävnadsreparation in vivo . I dessa granulära byggnadsställningar möjliggör den medfödda porositeten som genereras av tomrummet mellan mikrogeler cellinfiltration och migration. Att kontrollera tomrumsfraktionen och partikelfraktionen är avgörande för MAP-ställningens design, eftersom porositet är en bioaktiv ledtråd för celler. Sfäriska mikrogeler kan genereras på en mikrofluidisk anordning för kontrollerad storlek och form och därefter frystorkas med metoder som förhindrar sprickbildning av polymernätverket. Vid rehydrering leder de frystorkade mikrogelerna till kontrollerade partikelfraktioner i MAP-ställningar. Implementeringen av dessa metoder för mikrogellyofilisering har lett till reproducerbara studier som visar effekten av partikelfraktion på makromolekyldiffusion och cellspridning. Följande protokoll kommer att täcka tillverkning, frystorkning och rehydrering av mikrogeler för att kontrollera partikelfraktion i MAP-byggnadsställningar, samt glödgning av mikrogelerna genom bio-ortogonal tvärbindning för 3D-cellodling in vitro.
Introduction
Mikroporösa glödgade partikelställningar (MAP) är en underklass av granulära material där mikrogelbyggstenarna (μgel) är sammankopplade för att bilda en bulk, porös byggnadsställning. Med den unika mikroarkitekturen hos dessa granulära byggnadsställningar stöder den medfödda porositeten som genereras av tomrummet mellan sammanlänkad sfärisk mikrogel accelererad cellinfiltration och migration1. Mikrogelbyggstenarna i MAP-ställningar kan tillverkas av både syntetiska och naturliga polymerer med kemiska modifieringar2. Metoderna som beskrivs här belyser specifikt användningen av mikrogeler som består av en hyaluronsyra (HA) ryggrad modifierad med funktionella norbornen (NB) handtag. NB-funktionshandtaget på HA-polymeren stöder klickkemiska reaktioner för att bilda mikrogeler och länka dem samman för att generera MAP-ställningar 3,4. Många scheman har använts för att länka mikrogelerna tillsammans (dvs. glödgning), såsom enzymatisk1, ljusbaserad 5,6 och additivfri klickkemi 3,7 reaktioner. Additivfri klickkemi beskrivs i detta arbete, med hjälp av tetrazin-norbornen invers elektronbehov Diels-Alder-konjugering för sammankoppling av HA-NB-mikrogelerna.
För att tillverka MAP-ställningar genererar användarna först mikrogelbyggstenarna med hjälp av omvända emulsioner antingen i batchsystem eller inom mikrofluidiska enheter, samt med elektrohydrodynamisk sprutning, litografi eller mekanisk fragmentering2. Produktionen av sfäriska HA-NB-mikrogeler har beskrivits väl och tidigare rapporterats med hjälp av både batchemulsion2 och mikrofluidiska droppgenereringstekniker 8,9,10,11. I detta arbete genererades sfäriska HA-NB-mikrogeler på en flödesfokuserande mikrofluidisk plattform för kontrollerad storlek och form, som tidigare beskrivits 8,9,10. Efter rening existerar mikrogelerna i en vattenhaltig suspension och måste koncentreras för att inducera ett fastnat tillstånd. När de har fastnat uppvisar mikrogeler skjuvförtunnande egenskaper, vilket gör att de kan fungera som injicerbara, rymdfyllande material1. En metod för att inducera ett fastnat tillstånd är att torka mikrogelerna via frystorkning eller frystorkning och sedan rehydrera den torkade produkten i en kontrollerad volym12. Alternativt kan överskottsbuffert avlägsnas från mikrogeluppslamningen via centrifugering över en sil eller med manuellt avlägsnande av bufferten från mikrogelpelleten antingen genom aspiration eller med hjälp av ett absorberande material. Att använda centrifugering för att torka mikrogelerna kan emellertid generera ett mycket varierande intervall av partikelfraktioner och tomrumsfraktioner vid tillverkning av granulära byggnadsställningar12. Tekniker för att frysofila mikrogeler har beskrivits med 70% IPA för polyetylenglykol (PEG) mikrogeler13, fluorerade oljor för gelatinmetakryloyl (GelMa) mikrogeler 14 och 70% etanol för HA-mikrogeler12. Detta protokoll belyser metoder för frystorkning av sfäriska HA-mikrogeler med användning av 70% etanol, ett standardlaboratoriereagens, för att behålla de ursprungliga mikrogelegenskaperna under torkningsprocessen. De frystorkade HA-mikrogelerna kan vägas och rehydreras med användardefinierade viktprocent för att kontrollera de slutliga partikelfraktionerna i MAP-ställningar12.
Det sista steget i MAP-ställningsbildning bygger på glödgning av mikrogelerna för att skapa en bulk, porös byggnadsställning1. Genom att använda inbyggda extracellulära matriskomponenter och använda bio-ortogonala glödgningsscheman fungerar MAP-ställningar som en biokompatibel plattform för både in vitro-cellodling och in vivo-vävnadsreparation3. Genom dessa tillvägagångssätt kan MAP-ställningar tillverkas av HA-NB-byggstenar med användardefinierade partikelfraktioner för deras anställning i vävnadstekniska applikationer12. Följande protokoll beskriver den mikrofluidiska produktionen av HA-NB-mikrogeler följt av frystorkning och rehydrering för kontroll av partikelfraktion i MAP-byggnadsställningar. Slutligen beskrivs steg för glödgning av mikrogelerna med hjälp av bio-ortogonal kemi för in vitro 3D-cellodlingsexperiment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikrofluidisk produktion av HA-NB-mikrogeler har visat sig generera mikrogeler med ett smalare storleksintervall än emulsionsbatchproduktion 3,9. Mikrogelerna som beskrivs i detta protokoll formulerades med användning av en MMP-klyvbar tvärbindare (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) för att stödja materialnedbrytning. HA-NB-mikrogeler kan emellertid också tvärbindas med hjälp av en alternativ di-tiollänkare såsom ditiotreitol (DTT), som inte är nedbr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka National Institutes of Health, National Institutes of Neurological Disorders and Stroke (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599) och National Institute of Allergy and Infectious Disease (1R01AI152568). Detta arbete utfördes delvis vid Duke University Shared Materials Instrumentation Facility (SMIF), en medlem av North Carolina Research Triangle Nanotechnology Network (RTNN), som stöds av National Science Foundation (prisnummer ECCS-2025064) som en del av National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI). Författarna vill tacka labbets tidigare post-doc Dr. Lucas Schirmer samt Ethan Nicklow för deras hjälp med att generera den 3D-tryckta enheten för cellodlingsexperiment.
Materials
| 1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309628 | |
| 5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309646 | |
| Alexa Fluor 488 C5 maleimide | Invitrogen | A10254 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | For staining cell culture samples |
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Biopsy punch with plunger, 1.0 mm | Integra Miltex | 69031-01 | |
| Biopsy punch, 4 mm | Integra Miltex | 33-34 | |
| Blunt needle, 23 G 0.5", Non-Sterile, Capped | SAI Infusion Technologies | B23-50 | |
| Bottle-top vacuum filter, 0.22 μm | Corning | CLS430521 | |
| Calcium chloride | VWR | 1B1110 | For microgel washing buffer |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 1000 μL max. volume | Rainin | 17008609 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 25 μL max. volume | Rainin | 17008605 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 250 μL max. volume | Rainin | 17008608 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Centrifuge tube, 15 mL | CELLTREAT | 667015B | |
| Centrifuge tube, 50 mL | CELLTREAT | 229421 | |
| Chloroform, ACS grade, Glass Bottle | Stellar Scientific | CP-C7304 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Corona plasma gun, BD-10A High Frequency Generator | ETP | 11011 | |
| CryoTube Vials, Polypropylene, Internal Thread with Screw Cap | Nunc | 368632 | |
| D1 mouse mesenchymal cells | ATCC | CRL-12424 | Example cell line for culture in MAP gels |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | For staining cell culture samples |
| Deuterium oxide, 99.9 atom% D | Sigma-Aldrich | 151882 | For NMR spectroscopy |
| Dialysis tubing, regenerated cellulose membrane, 12-14 kDa molecular weight cut-off | Spectra/Por | 132703 | For purifying HA-NB and HA-Tet |
| Diethyl ether | VWR | BDH1121-4LPC | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 277056 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM) | TCI-Chemicals | D2919 | For modifying HA |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | Non-degradable dithiol linker (substitute for MMP-cleavable peptide) |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | For D1 cell culture |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 4% PFA |
| Ethanol absolute (200 proof) | KOPTEC | 89234-850 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | For D1 cell culture |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| Hemacytometer with coverglass | Daigger Scientific | EF16034F | |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sodium hyaluronate, 79 kDa average molecular weight, produced in bacteria Streptococcus zooepidemicus, pharmaceutical grade, microbial contamination <100 CFU/g, bacterial endotoxins <0.050 IU/mg | Contipro | N/A | 79 kDa average molecular weight was used for HA-Tet synthesis, but these methods could be adapted for other molecular weights. |
| IMARIS Essentials software package | Oxford Instruments | N/A | Microscopy image analysis software |
| Infusion pump, dual syringe | Chemyx | N/A | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Laboratory stand with support lab clamp | Geyer | 212100 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI 180LT22 | |
| Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate | TCI-Chemicals | L0290 | |
| Lyophilizer | Labconco | N/A | Labconco FreeZone 6 plus has been discontinued, but other lab grade console freeze dryers could be used for this protocol. |
| Methyltetrazine-PEG4-maleimide | Kerafast | FCC210 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | For modifying HA |
| Micro cover glass, 24 x 60 mm No. 1 | VWR | 48393-106 | |
| Microfluidic device SU8 master wafer | FlowJem | Custom design made either in-house in clean room or outsourced | |
| Mineral oil, heavy | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| 5-Norbornene-2-methylamine | TCI-Chemicals | 95-10-3 | For HA-NB synthesis |
| Packing tape | Scotch | 3M 1426 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| PEG(thiol)2 | JenKem Technology USA | A4001-1 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Penicillin-Streptomycin, 10,000 units/mL | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | For D1 cell culture |
| Petri dish, polystyrene, disposable, Dia. x H=150 x 15 mm | Corning | 351058 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | For washing HMPs |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010023 | |
| RainX water repellent glass treatment | Grainger | 465D20 | Synthetic hydrophobic treatment solution for microfluidic device treatment |
| RGD peptide (Ac-RGDSPGERCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| Rubber bands | Staples | 112417 | |
| Sodium chloride | Chem-Impex | 30070 | For dialysis |
| Span 80 for synthesis | Sigma-Aldrich | 1338-43-8 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Electron Microscopy Science | 4019862 | polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer for making microfluidic devices and tissue culture devices |
| Syringe filter, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES, 13 mm diameter | Cytvia | 09-928-066 | |
| Tetraview LCD digital microscope | Celestron | 44347 | |
| Tetrazine-amine HCl salt | Chem-Impex | 35098 | For HA-Tet synthesis |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Millipore Sigma | 51805-45-9 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin EDTA (0.25%), Phenol red | Fisher Scientific | 25-200-056 | For lifting adherent cells to seed in MAP gels |
| Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal diameter = 0.020, Outer diameter = 0.060 in | Thomas Scientific | 1204G82 | |
| UV curing system controller, LX500 LED | OmniCure | 010-00369R | |
| UV curing head, LED spot UV | OmniCure | N/A | |
| UV light meter, Traceable | VWR | 61161-386 | |
| Vacuum dessicator | Bel-Art | 08-594-15C | |
| X-Acto Z Series Precision Utility Knife | Elmer's | XZ3601W |
References
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Darling, N. J., et al. Click by click Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
- Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2020).
- Pfaff, B. N., et al. Selective and improved photoannealing of Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).
- Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
- Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Wilson, K. L., et al. Stoichiometric post modification of hydrogel microparticles dictates neural stem cell fate in microporous annealed particle scaffolds. Advanced Materials. 34 (33), 2201921 (2022).
- Muir, V. G., Qazi, T. H., Shan, J., Groll, J., Burdick, J. A. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2018).
- Anderson, A. R., Nicklow, E., Segura, T. Particle fraction as a bioactive cue in granular scaffolds. Acta Biomaterialia. 150, 111-127 (2022).
- Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. R. Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure. Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).
- Sheikhi, A., et al. Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions. ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. Journal of Visualized Experiments. (119), e55276 (2017).
- JoVE. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. JoVE. , (2022).
- Roosa, C., et al. Microfluidic synthesis of microgel building blocks for microporous annealed particle scaffold. Journal of Visualized Experiments. (184), e64119 (2022).
- Zhang, H., Dicker, K. T., Xu, X., Jia, X., Fox, J. M. Interfacial bioorthogonal crosslinking. ACS Macro Letters. 3 (8), 727-731 (2014).
- Welzel, P. B., et al. Cryogel micromechanics unraveled by atomic force microscopy-based nanoindentation. Advanced Healthcare Materials. 3 (11), 1849-1853 (2014).
- Plieva, F., Huiting, X., Galaev, I. Y., Bergenståhl, B., Mattiasson, B. Macroporous elastic polyacrylamide gels prepared at subzero temperatures: control of porous structure. Journal of Materials Chemistry. 16 (41), 4065-4073 (2006).
- Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
- Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
- Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
- Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in Microporous Annealed Particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
- Koh, J., et al. Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds. Small. 15 (39), 1903147 (2019).
- Li, F., et al. Cartilage tissue formation through assembly of microgels containing mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 77, 48-62 (2018).
