En elektroporationsmetode til at omdanne Rickettsia spp. med en fluorescerende proteinekspressiv shuttlevektor i flåtcellelinjer
Summary
Elektroporation er en hurtig, bredt vedtaget metode til at indføre eksogent DNA i slægten Rickettsia. Denne protokol giver en nyttig elektroporationsmetode til omdannelse af obligatoriske intracellulære bakterier i slægten Rickettsia.
Abstract
Rickettsioses er forårsaget af en bred vifte af obligatoriske intracellulære bakterier, der tilhører slægten Rickettsia , der kan overføres til hvirveldyrværter gennem bid af inficerede leddyrvektorer. Til dato er nye eller genopståede epidemiske rickettsioser fortsat en folkesundhedsrisiko på grund af vanskeligheden ved diagnosen, da diagnostiske metoder er begrænsede og ikke standardiserede eller universelt tilgængelige. Fejldiagnose som følge af manglende anerkendelse af tegn og symptomer kan resultere i forsinket antibiotikabehandling og dårlige sundhedsresultater. En omfattende forståelse af Rickettsia-egenskaber ville i sidste ende forbedre klinisk diagnose, vurdering og behandling med forbedret kontrol og forebyggelse af sygdommen.
Funktionelle undersøgelser af rickettsiale gener er afgørende for at forstå deres rolle i patogenese. Dette papir beskriver en procedure for elektroporation af Rickettsia parkeri-stammen Tate’s Hell med shuttle-vektoren pRAM18dSFA og udvælgelsen af transformeret R. parkeri i flåtcellekultur med antibiotika (spectinomycin og streptomycin). En metode er også beskrevet til lokalisering af transformeret R. parkeri i flåtceller ved anvendelse af konfokal immunfluorescensmikroskopi, en nyttig teknik til kontrol af transformation i vektorcellelinjer. Lignende tilgange er også velegnede til omdannelse af andre rickettsiae.
Introduction
Rickettsioses er forårsaget af en bred vifte af obligatoriske intracellulære bakterier, der tilhører slægten Rickettsia (familie Rickettsiaceae, orden Rickettsiales). Slægten Rickettsia er klassificeret i fire hovedgrupper baseret på fylogenetiske egenskaber1,2: den plettede febergruppe (SFG), som indeholder de rickettsiae, der forårsager de mest alvorlige og dødelige flåtbårne rickettsioser (f.eks. Rickettsia rickettsii, det forårsagende middel til Rocky Mountain Spotted Fever), tyfusgruppen (TG, fx Rickettsia prowazekii, agent for epidemisk tyfus), overgangsgruppen (TRG, f.eks. Rickettsia felis, det forårsagende middel til loppebåren plettet feber) og forfædregruppen (AG, f.eks. Rickettsia bellii).
Blandt de ældste kendte vektorbårne sygdomme erhverves rickettsioser hovedsageligt efter overførsel af patogenerne gennem bid af inficerede leddyrvektorer, herunder flåter, lopper, lus og mider 3,4. Selvom opdagelsen af effektive antibiotika forbedrede behandlingsresultaterne, udfordrer nye og genopståede epidemiske rickettsioser fortsat traditionelle forebyggelses- og kontrolstrategier. Således ville en omfattende forståelse af rickettsia / vært / vektorinteraktioner i sidste ende etablere et stærkt fundament for at udvikle nye tilgange til forebyggelse og helbredelse af disse gamle sygdomme.
I naturen forekommer vandret genoverførsel (HGT) i bakterier gennem konjugation, transduktion og transformation5. In vitro bakteriel transformation udnytter disse HGT-begreber, selvom den intracellulære karakter af rickettsiae giver nogle udfordringer. De begrænsede vækstbetingelser og dårligt forstået konjugations- og transduktionssystemer i forskellige arter af rickettsiae har forhindret anvendelsen af konjugations- og transduktionsmetoder i rickettsiae 6,7,8. Sammenlignet med andre obligatoriske intracellulære bakterieslægter (f.eks. Chlamydia, Coxiella, Anaplasma og Ehrlichia) adskiller slægten Rickettsia sig med hensyn til vækst- og replikationsstrategier inden for cellecytoplasmaet, hvilket medfører specifikke udfordringer for den genetiske modifikation af rickettsiae på grund af deres unikke livsstilstræk9.
Den første forhindring, der skal overvindes, når man forsøger genetisk modifikation af rickettsiae, er at opnå en vellykket transformation. Således ville design af en gennemførlig tilgang med høj transformationseffektivitet være yderst værdifuld for udvikling af genetiske værktøjer til rickettsiae. Her fokuserer vi på elektroporation, en bredt anerkendt transformationsmetode, der er blevet brugt til at introducere eksogent DNA med succes i flere arter af rickettsiae, herunder Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii og Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.
Dette papir beskriver en procedure for elektroporation af R. parkeri-stammen Tate’s Hell (tiltrædelse: GCA_000965145.1) med shuttlevektoren pRAM18dSFA afledt af Rickettsia amblyommatis-stammen AaR/SC-plasmid pRAM18, der er konstrueret til at kode mKATE, et langt rødt fluorescerende protein, og aadA, hvilket giver spectinomycin og streptomycinresistens13,15,20. Transformeret R. parkeri er levedygtige og stabilt vedligeholdt under antibiotikaudvælgelse i flåtcellelinjer. Derudover viser vi, at lokaliseringen af transformeret R. parkeri i levende flåtceller via konfokal mikroskopi kan bruges til at vurdere kvaliteten af transformationshastigheder i vektorcellelinjer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her demonstrerer vi en metode til at introducere eksogent DNA kodet på shuttleplasmidet pRAM18dSFA i rickettsiae ved hjælp af elektroporation. I denne procedure blev cellefri rickettsiae renset fra værtsceller, omdannet med en rickettsial shuttle-vektor og frigivet på flåtceller til infektion. Også beskrevet er en konfokal immunfluorescensprocedure til påvisning af rød fluorescensprotein-ekspressive R. parkeri i flåtceller. Lignende metoder kan anvendes på andre Rickettsia-arter og kan med yde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Timothy J. Kurtti og Benjamin Cull for deres indsigtsfulde diskussioner og forslag. Denne undersøgelse blev økonomisk støttet af et tilskud til U.G.M. fra NIH (2R01AI049424) og et tilskud til U.G.M. fra Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078).
Materials
| 0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| 2 μm pore size filter | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 6783-2520 | |
| 5 mL Luer-lock syringe | BD | 309646 | |
| 60-90 silicon carbide grit | LORTONE, inc | 591-056 | |
| absolute methanol | Fisher Scientific | A457-4 | |
| Bacto tryptose phosphate broth | BD | 260300 | |
| Cytospin centrifuge Cytospin4 | Thermo Fisher Scientific | A78300003 | The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | QIAGEN | 12362 | used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid |
| extended fine tip transfer pipet | Perfector Scientific | TP03-5301 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it. |
| Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS | Bio-Rad | 165-2105 & 165-2110 | |
| hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 267110 | |
| HEPES | Millipore-Sigma | H4034 | |
| ImageJ Fiji | National Institute of Health | raw image editing | |
| KaryoMAX Giemsa stain | Gibco | 2021-10-30 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco | 41300039 | |
| lipoprotein concentrate | MP Biomedicals | 191476 | |
| Nikon Diaphot | Nikon | epifluorescence microscope | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
| Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope | Olympus | ||
| Petroff-Hausser Counting Chamber | Hausser Scientific | Chamber 3900 | |
| sodium bicarbonate | Millipore-Sigma | S5761 | |
| Vortex | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 |
References
- Gillespie, J. J., et al. Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis. PLoS One. 2 (3), 266 (2007).
- Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution. Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).
- Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts. Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).
- Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. Rickettsiae as emerging infectious agents. Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).
- Von Wintersdorff, C. J., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, 173 (2016).
- Winkler, H. H. Rickettsia species (as organisms). Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).
- Wood, D. O., Azad, A. F. Genetic manipulation of rickettsiae: A preview. Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).
- Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. The emerging diversity of Rickettsia. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).
- McClure, E. E., et al. Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).
- Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).
- Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation. Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).
- Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).
- Burkhardt, N. Y., et al. Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species. PLoS One. 6 (12), 29511 (2011).
- Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion. PloS One. 7 (5), 37310 (2012).
- Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene. Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).
- Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions. Veterinary Sciences. 3 (4), 34 (2016).
- Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype. Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).
- Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells. Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).
- Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. Tick cell Lines in research on tick control. Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).
- Wang, X. R., et al. Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells. mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
- Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species. Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).
- Burkhardt, N. Y., et al. Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis. Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).
- Kurtti, T. J., et al. Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).
- Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Formulation of medium for tick cell culture. Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).
- Bell-Sakyi, L. Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum. The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).
- Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae). Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).
- Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata. Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).
