Etablering av 3-dimensjonale sfæroider fra pasientavledede tumorprøver og evaluering av deres følsomhet overfor legemidler
Summary
Den nåværende protokollen beskriver generering av 3D-tumorkulturmodeller fra primære kreftceller og evaluering av deres følsomhet overfor legemidler ved hjelp av celle-levedyktighetsanalyser og mikroskopiske undersøkelser.
Abstract
Til tross for bemerkelsesverdige fremskritt i forståelsen av tumorbiologi, mislykkes det store flertallet av onkologiske legemiddelkandidater som går inn i kliniske studier, ofte på grunn av mangel på klinisk effekt. Denne høye feilfrekvensen belyser manglende evne til dagens prekliniske modeller til å forutsi klinisk effekt, hovedsakelig på grunn av deres utilstrekkelighet i å reflektere tumorheterogenitet og tumormikromiljøet. Disse begrensningene kan løses med 3-dimensjonale (3D) kulturmodeller (sfæroider) etablert fra humane tumorprøver avledet fra individuelle pasienter. Disse 3D-kulturene representerer virkelighetsbiologi bedre enn etablerte cellelinjer som ikke reflekterer tumorheterogenitet. Videre er 3D-kulturer bedre enn 2-dimensjonale (2D) kulturmodeller (monolagsstrukturer) siden de replikerer elementer i tumormiljøet, som hypoksi, nekrose og celleadhesjon, og bevarer den naturlige celleformen og veksten. I denne studien ble det utviklet en metode for å forberede primære kulturer av kreftceller fra individuelle pasienter som er 3D og vokser i multicellulære sfæroider. Cellene kan utledes direkte fra pasienttumorer eller pasientavledede xenotransplantater. Metoden er allment anvendelig for solide svulster (f.eks. Kolon, bryst og lunge) og er også kostnadseffektiv, da den kan utføres i sin helhet i et typisk kreftforsknings- / cellebiologilaboratorium uten å stole på spesialutstyr. Her presenteres en protokoll for å generere 3D-tumorkulturmodeller (multicellulære sfæroider) fra primære kreftceller og evaluere deres følsomhet overfor legemidler ved hjelp av to komplementære tilnærminger: en celle-levedyktighetsanalyse (MTT) og mikroskopiske undersøkelser. Disse multicellulære sfæroidene kan brukes til å vurdere potensielle legemiddelkandidater, identifisere potensielle biomarkører eller terapeutiske mål, og undersøke mekanismene for respons og resistens.
Introduction
In vitro og in vivo studier representerer komplementære tilnærminger for å utvikle kreftbehandling. In vitro-modeller muliggjør kontroll av de fleste eksperimentelle variabler og legger til rette for kvantitative analyser. De fungerer ofte som rimelige screeningplattformer og kan også brukes til mekanistiske studier1. Imidlertid er deres biologiske relevans iboende begrenset, da slike modeller bare delvis reflekterer tumormikromiljøet1. In vivo-modeller, som pasientavledede xenotransplantater (PDX), fanger derimot kompleksiteten i tumormikromiljøet og er mer egnet for translasjonsstudier og individualiserende behandling hos pasienter (dvs. undersøkelse av respons på legemidler i en modell avledet fra en individuell pasient)1. In vivo-modeller bidrar imidlertid ikke til høykapasitetstilnærminger for narkotikascreening, ettersom de eksperimentelle parametrene ikke kan kontrolleres like tett som in vitro-modeller, og fordi utviklingen er tidkrevende, arbeidskrevende og kostbar 1,2.
In vitro-modeller har vært tilgjengelige i over 100 år, og cellelinjer har vært tilgjengelige i over 70 år3. I løpet av de siste tiårene har imidlertid kompleksiteten til de tilgjengelige in vitro-modellene av solide svulster økt dramatisk. Denne kompleksiteten spenner fra 2-dimensjonale (2D) kulturmodeller (monolagsstrukturer) som enten er tumoravledede etablerte cellelinjer eller primære cellelinjer til de nyere tilnærmingene som involverer 3-dimensjonale (3D) modeller1. Innenfor 2D-modellene er det et sentralt skille mellom de etablerte og primære cellelinjene4. Etablerte cellelinjer er foreviget; Derfor kan den samme cellelinjen brukes globalt over mange år, noe som i et historisk perspektiv letter samarbeid, akkumulering av data og utvikling av mange behandlingsstrategier. Imidlertid akkumuleres genetiske avvik i disse cellelinjene med hver passasje, og kompromitterer dermed deres biologiske relevans. Videre reflekterer det begrensede antallet tilgjengelige cellelinjer ikke heterogeniteten til svulster hos pasienter 4,5. Primære kreftcellelinjer er avledet direkte fra resekterte tumorprøver oppnådd via biopsier, pleural effusjoner eller reseksjoner. Derfor er primære kreftcellelinjer mer biologisk relevante da de bevarer elementer av tumormikromiljøet og tumoregenskapene, for eksempel intercellulær atferd (f.eks. Kryssprat mellom friske og kreftceller) og de stamlignende fenotypene av kreftceller. Imidlertid er replikasjonskapasiteten til primære cellelinjer begrenset, noe som fører til en smal kulturtid og begrenser antall tumorceller som kan brukes til analyser 4,5.
Modeller som bruker 3D-kulturer er mer biologisk relevante enn 2D-kulturmodeller siden in vivo-betingelsene beholdes. Dermed bevarer 3D-kulturmodeller den naturlige celleformen og veksten og replikerer elementer i tumormiljøet, som hypoksi, nekrose og celleadhesjon. De mest brukte 3D-modellene i kreftforskning inkluderer flercellede sfæroider, stillasbaserte strukturer og matrise-innebygde kulturer 4,6,7.
Den nåværende protokollen genererer 3D-tumorkulturmodeller (multicellulære sfæroider) fra primære kreftceller og evaluerer deres følsomhet overfor legemidler ved hjelp av to komplementære tilnærminger: en celle-levedyktighetsanalyse (MTT) og mikroskopiske undersøkelser. De representative resultatene som presenteres her er fra bryst- og tykktarmskreft; Imidlertid er denne protokollen allment anvendelig for andre solide tumortyper (f.eks. Kolangiokarcinom, mage-, lunge- og bukspyttkjertelkreft) og er også kostnadseffektiv, da den kan utføres i sin helhet i et typisk kreftforsknings- / cellebiologilaboratorium uten å stole på spesialutstyr. De multicellulære sfæroidene som genereres ved hjelp av denne tilnærmingen, kan brukes til å vurdere potensielle legemiddelkandidater, identifisere potensielle biomarkører eller terapeutiske mål, og undersøke mekanismene for respons og motstand.
Denne protokollen er delt inn i tre seksjoner: (1) generering, innsamling og telling av sfæroider som forberedelse til bruk som modell for testing av legemiddeleffektivitet; (2) MTT-analyse for å vurdere legemiddeleffekt på sfæroidene; og (3) mikroskopisk evaluering av morfologiske endringer etter behandling av sfæroidene med legemidler som en annen tilnærming for å evaluere legemiddeleffekt (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Den foreliggende protokollen beskriver en enkel metode for å generere 3D primære cellekulturer (sfæroider) avledet fra humane tumorprøver. Disse sfæroidene kan brukes til ulike analyser, inkludert evaluering av potensielle legemiddelkandidater og legemiddelkombinasjoner, identifisering av potensielle biomarkører eller terapeutiske mål, og undersøkelse av mekanismer for respons og resistens. Protokollen bruker enten primære tumorceller avledet direkte fra pasientprøver eller tumorceller fra PDX-modeller, som kan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen.
Materials
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
| Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Basement membrane matrix, type 3 |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer ELISA reader | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.52a | Open-source software ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
| L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium |
| Penicillin–streptomycin | Invitrogen | 2119399 | |
| Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| Pippeting reservoir | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann – La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
| Ultra-low attachment 96 well plate | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
References
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
- Richter, M., et al. From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381 (2021).
- Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy. Revista de Investigación Clínica. 71 (6), 369-380 (2019).
- Choi, J. R., et al. In vitro human cancer models for biomedical applications. Cancers. 14 (9), 2284 (2022).
- Eglen, R. M., Randle, D. H. Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).
- Kodack, D. P., et al. Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care. Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).
- Moskovits, N., et al. Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types. Cancer Letters. 536, 215665 (2022).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).
- Brajša, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jelić, D. Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery. Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).
- Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell International. 21 (1), 152 (2021).
- van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: The MTT assay. Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).
- Walzl, A., et al. The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).
