वर्तमान प्रोटोकॉल मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (आईपीएससी) से प्राप्त सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पीढ़ी, रखरखाव और उम्र बढ़ने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रक्रिया प्रदान करता है। यह विधि विस्तारित अवधि के लिए सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स को संवर्धन और परिपक्व करने में सक्षम बनाती है, जो मस्तिष्क की उम्र बढ़ने और उम्र से संबंधित रोगजनन में शामिल प्रक्रियाओं के मॉडलिंग की सुविधा प्रदान करती है।
वर्तमान में उपलब्ध पशु और सेलुलर मॉडल उम्र बढ़ने वाले मानव मस्तिष्क में होने वाले परिवर्तनों की जटिलता को पूरी तरह से पुन: परिभाषित नहीं करते हैं। मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (आईपीएससी) से प्राप्त मानव सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी का वर्णन करने वाली प्रक्रियाओं के एक हालिया विकास में मानव मस्तिष्क और संबंधित रोगजनक प्रक्रियाओं की उम्र बढ़ने को मॉडल करने और समझने की क्षमता को मौलिक रूप से बदलने की क्षमता है। यहां, मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स को उत्पन्न करने, बनाए रखने, उम्र बढ़ने और विशेषता के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। इस प्रोटोकॉल को प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए लागू किया जा सकता है और एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका के रूप में कार्य करता है, जिसमें नवीनतम तकनीकों को शामिल किया जाता है जिसके परिणामस्वरूप संस्कृति में बेहतर ऑर्गेनॉइड परिपक्वता और उम्र बढ़ने होता है। ऑर्गेनॉइड परिपक्वता, परिगलन, परिवर्तनशीलता और बैच प्रभाव से संबंधित विशिष्ट मुद्दों को संबोधित किया जा रहा है। एक साथ लिया गया, ये तकनीकी प्रगति विभिन्न प्रकार के युवा और वृद्ध मानव दाताओं के साथ-साथ उम्र से संबंधित मस्तिष्क विकारों से पीड़ित व्यक्तियों से प्राप्त ऑर्गेनोइड्स में मस्तिष्क की उम्र बढ़ने के मॉडलिंग की अनुमति देगी, जिससे मानव मस्तिष्क की उम्र बढ़ने के शारीरिक और रोगजनक तंत्र की पहचान की जा सकेगी।
उम्र बढ़ने के रोग मॉडल तेजी से प्रासंगिक हो गए हैं क्योंकि मानव जीवन प्रत्याशा में वृद्धि जारी है। बड़े पैमाने पर जीनोमिक अध्ययनों ने आणविक प्रक्रियाओं की विकृति और जीवन की गुणवत्ता को प्रभावित करने वाले आनुवंशिक परिवर्तनों के साथ वृद्ध आबादी को उजागरकिया है। उम्र बढ़ने की प्रक्रिया को जीव की कार्यक्षमता के सामान्य नुकसान की विशेषता है, जिसमें संज्ञानात्मक कार्य का नुकसान, न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के लिए जोखिम में वृद्धि और पुरानी बीमारियों कीमेजबानी शामिल है।
वर्तमान सेल कल्चर तकनीक उचित रूप से उम्र बढ़ने की बहुक्रियात्मक प्रकृति का प्रतिनिधित्व नहीं करती है, क्योंकि इन शिथिलताओं को उत्परिवर्तन, विषाक्त पदार्थों यासंक्रमणों का उपयोग करके ठीक से दोहराया नहीं जा सकता है। उम्र बढ़ने की प्रक्रिया का पता लगाने वाले पशु मॉडल अक्सर लंबे प्रयोगात्मक समय और उच्च लागत से जुड़े होते हैं, लेकिन उनके साथ नैतिक विचार भी लाते हैं। रोगियों से प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) का उपयोग आणविक तंत्र को स्पष्ट कर सकता है जो रोग की प्रगति को कम करता है क्योंकि आईपीएससी परिपक्व ऊतक में कोशिकाओं के प्राकृतिक विकास की अनुमतिदेता है। आईपीएससी न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों की जांच करने वाली कई प्रयोगशालाओं का कामकाजी घोड़ा बन गया है, क्योंकि कटी हुई कोशिकाओं की सेलुलर रीप्रोग्रामिंगदाताओं की बीमारी या उम्र बढ़ने की छाप को मिटाती नहीं है। ये छाप मानव और पशु मॉडल में प्रदर्शित सेलुलर फेनोटाइप्स को पुन: प्रस्तुत करते हैं, जिससे आईपीएससी अत्यधिक घने मस्तिष्क ऊतक 5,6 की व्यक्तिगत सेलुलर गिरावट की जांच के लिए उपयुक्त हो जाते हैं। आईपीएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड ऊतक के त्रि-आयामी संवर्धन के लिए प्रमुख मॉडल बन गए हैं, जो अधिक जटिल सेल-टू-सेल इंटरैक्शन और एक बेहतर विकासात्मक पुनर्पूंजीकरण को सक्षम करते हैं। यद्यपि मुख्य रूप से विकास ता्मक डेटा के लिए उपयोग किया जाता है, ऑर्गेनोइड्स को रोग मॉडलिंग की ओर तेजी से लागू किया गया है, विशेष रूप से सूजन, न्यूरोडीजेनेरेशन और उम्र बढ़ने के लिए मॉडल7। पिछले आईपीएससी अध्ययनों के आधार पर, ऑर्गेनोइड ऊतक जैसे नेटवर्क कनेक्शन8,9 के शारीरिक संदर्भ में रोग फेनोटाइप और सेलुलर फेनोटाइप को बनाए रखते हैं। हालांकि, कुछ आयामों के त्रि-आयामी ऊतक की खेती करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, खासकर विस्तारित अवधि के लिए।
यह काम सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पीढ़ी के लिए एक विस्तृत विधि प्रस्तुत करता है जो ऊतक को लंबे समय तक आकार में काफी हद तक परिपक्व होने की अनुमति देता है। सेरेब्रल ऑर्गेनॉइड निर्माण अपेक्षाकृत मानकीकृत रहा है, कई प्रमुख प्रोटोकॉल10,11 से तरीकों को अपनाते हुए। हालांकि, बेहतर भेदभाव और रखरखाव के लिए कई संशोधनों का सुझाव दिया गया है। इन वैकल्पिक तरीकों में तंत्रिका विभेदन को बढ़ाने के लिए न्यूरोजेनिक कारकों का उपयोग करना शामिल है12, सेलुलर दीर्घायु को बढ़ावा देने वाले बेहतर पोषक तत्व विनिमय के लिए अतिरिक्त मचान13, और लंबे समय तक संस्कृतिऔर विकास के लिए कम तनाव आंदोलन। न्यूरोडीजेनेरेटिव और उम्र बढ़ने के फेनोटाइप को व्यक्त करने में सक्षम परिपक्व ऑर्गेनोइड विकसित करने के लिए इन सुधारों को इस विधि में शामिल किया गया है।
ईबी का मानकीकृत गठन प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रूपांतरण में एक महत्वपूर्ण कदम है। एकवचन ऊतकों में स्टेम कोशिकाओं का बल एकत्रीकरण अवतल कुओं की ज्यामिति, सीडिंग घनत्व और अच्छी तरह से उपचार के आधार पर भिन्न हो सकता है। यद्यपि वर्तमान विधि 6 दिनों के बाद 500-600 μm की व्यास सीमा का हवाला देती है, ये व्यास उचित ऑर्गेनोइड गठन के अन्य व्यास को बाहर नहीं करते हैं, क्योंकि कई अन्य व्यास सफल साबित हुए हैं। हालांकि, अलग-अलग व्यास को भेदभाव दर और सफलता को प्रभावित करने के लिए दिखाया गयाहै। प्रजनन क्षमता उद्देश्यों के लिए, 50 μm से नीचे व्यास भिन्नताएंअत्यधिक अनुशंसित हैं। इसके अतिरिक्त, तंत्रिका प्रेरण दिनों की संख्या को ईबी को व्यास में बढ़ने की अनुमति देने के लिए 6 से 10 दिनों तक बढ़ाया जा सकता है, क्योंकि एसएमएडी अवरोधकों का उपयोग केवल 5 दिनों के एक्सपोजर30 के बाद न्यूरोएपिथेलिया गठन का कुशलतापूर्वक उत्पादन और रखरखाव करने के लिए दिखाया गया है। एसएमएडी अवरोधकों की अनुपस्थिति में, तंत्रिका प्रेरण असंगत परिणाम दे सकता है, जिसके लिए लंबी प्रेरण अवधि की आवश्यकता होती है। इस काम में उद्धृत एसएमएडी अवरोधक सबसे प्रभावी हैं, लेकिन अन्य डोर्सोमॉर्फिन और टीजीएफ-β छोटे अणुओं का उपयोग उनकी प्रभावी एकाग्रता पर किया जा सकता है।
तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स विकास के लिए एक उत्कृष्ट सब्सट्रेट प्रदान करता है और इसे अलग तरह से प्रशासित किया जा सकता है। मैट्रिक्स के शुरुआती उपयोगों में बेसल झिल्ली को एक अच्छी तरह से कोटिंग 31 के रूप में शामिल कियागया था। हालांकि, ऊतक को एम्बेड करने के लिए मैट्रिक्स के उपयोग नेइन ऊतकों में भेदभाव और परिपक्वता में सुधार किया। ऑर्गेनोइड्स के लिए, मैट्रिक्स का उपयोग ऑर्गेनोइड्स में ईबी भेदभाव में सुधार करने, परिपक्वता को बढ़ावा देने और संस्कृति अवधि33 का विस्तार करने के लिए दिखाया गया है। जबकि ऑर्गेनोइड्स अभी भी मैट्रिक्स के बिना बनाए जा सकते हैं, क्योंकि कई समूहों ने मैट्रिक्स-मुक्त ऊतकसंस्कृति 34,35 को पूरा करने का प्रयास किया है, अध्ययनों में पाया गया है कि मैट्रिक्स-एम्बेडेड ऑर्गेनोइड्स में लंबे समय तक संस्कृति समय की अधिक संभावना होती है औरकम रखरखाव की आवश्यकता होती है। एम्बेडिंग की डिंपल विधि ऑर्गेनॉइड सतह का समान कवरेज प्रदान करती है, समान प्रसार, पोषक तत्वों तक पहुंच और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य भेदभाव सुनिश्चित करती है। वैकल्पिक रूप से, गुंबद एम्बेडिंग को ऑर्गेनोइड्स37 को पूरी तरह से समाहित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।
झिल्ली मैट्रिक्स डिंपल में ईबी का हस्तांतरण एक महत्वपूर्ण कदम है। यद्यपि 1 एमएल पिपेट टिप में ईबी को स्थानांतरित करने के लिए पर्याप्त चौड़ा उद्घाटन होता है, स्थानांतरण में आसानी के लिए 200 μL टिप को प्राथमिकता दी जाती है। 200 μL युक्तियों को एक बड़ा पर्याप्त उद्घाटन बनाने के लिए काटने की आवश्यकता है, जिससे पाइपिंग करते समय कतरनी तनाव को कम करने के लिए एक चिकनी धार सुनिश्चित होती है। वैकल्पिक रूप से, स्थानांतरण में आसानी के लिए वाइड-बोर 200 μL युक्तियां मौजूद हैं। पाइपिंग को धीरे-धीरे करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि तेजी से पाइपिंग ऑर्गेनोइड परिधि को बाधित कर सकती है और उचित विकास में बाधा डाल सकती है। पोषक तत्व प्रदान करने के लिए पर्याप्त माध्यम हस्तांतरित किया जाता है, यह सुनिश्चित करने के लिए विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। बहुत कम माध्यम से ऑर्गेनोइड के सूखने का खतरा होता है, जिससे नेक्रोसिस होता है। ईबी को बहुत अधिक संस्कृति मीडिया के साथ स्थानांतरित करने से मैट्रिक्स बहुत पतला हो सकता है और ऑर्गेनॉइड को सुरक्षित रूप से समाहित करने में विफल हो सकता है। आदर्श रूप से, मैट्रिक्स को 50% से अधिक पतला नहीं किया जाना चाहिए ताकि इसके पोलीमराइजेशन को सुनिश्चित किया जा सके और ईबी के लिए ईसीएम के रूप में कार्य किया जा सके। यदि एम्बेडिंग असफल है, तो ईबी को पुनर्प्राप्त किया जा सकता है और फिर से समझाया जा सकता है। ताजा मैट्रिक्स में पुन: एनकैप्सुलेशन किसी भी बिंदु पर ऑर्गेनोइड को अतिरिक्त सहायता प्रदान करने के लिए किया जा सकता है।
मचान के लिए मैट्रिक्स एम्बेडिंग के समान, पीएलजीए फाइबर त्रि-आयामी विकास के लिए अतिरिक्त सहायता प्रदान करते हैं। मूल रूप से लम्बी ऑर्गेनोइड्स का उत्पादन करने और सतह क्षेत्र38 को बढ़ाने के लिए शामिल किया गया है, पीएलजीए फाइबर के समावेश को उत्तरोत्तर ऑर्गेनोइड भेदभाव और परिपक्वता में सुधार के लिए एक अतिरिक्त उपकरण के रूप में पहचाना गयाहै। जैसा कि अधिक प्रयोगशालाएं मैट्रिक्स के उपयोग को कम करने या इसे पूरी तरह से समाप्त करने की तलाश करती हैं, शामिल तंतुओं द्वारा समर्थित ऑर्गेनोइड्स के स्व-आयोजन गुण त्रि-आयामी ऊतक निर्माण और भेदभाव के लिए पर्याप्त मचान प्रदान करतेहैं। यहां, दीर्घकालिक संस्कृति38,39 की संभावना बढ़ाने के लिए दोनों तरीकों को जोड़ा गया था। प्रारंभिक एकत्रीकरण के दौरान तंतुओं का समावेश महत्वपूर्ण है, क्योंकि इन्हें बाद के चरण में पेश नहीं किया जा सकता है। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, यह जांचना कि कुछ फाइबर एकत्रित कोशिकाओं में से हैं, यह सुनिश्चित करेगा कि एक फाइबर ईबी में शामिल है। यदि सफल नहीं होता है, तो कुएं की एक कोमल आकांक्षा और पुन: सेंट्रीफ्यूजेशन को मिश्रण सुनिश्चित करना चाहिए।
ऑर्गेनॉइड रखरखाव में एक और महत्वपूर्ण कदम बेहतर मीडिया छिड़काव के लिए एक कक्षीय शेकर की शुरूआत है। ऑर्गेनॉइड प्रोटोकॉल के शुरुआती पुनरावृत्तियों में, आंदोलन11 बनाने के लिए एक स्पिनिंग बायोरिएक्टर का उपयोग किया गया था। 90 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर मैट्रिक्स बूंद को नष्ट किए बिना या ऑर्गेनोइड आकृति विज्ञान को नुकसान पहुंचाए बिना पर्याप्त आंदोलन प्रदान करता है। कुछ समूह मैट्रिक्स पाड़ का उपयोग करने से बचते हैं लेकिन उपयुक्त वातावरण प्रदान करने के लिए शेकर आंदोलन को बनाएरखते हैं। सभी प्रोटोकॉल के साथ, कतरनी तनाव की मात्रा को कम करने के लिए शेकर के आधार पर रोटेशन की गति को समायोजित किया जाना चाहिए। यदि एक गुंबद एम्बेडिंग चुना गया था, तो कतरनी तनाव11,34 की मात्रा को कम करने के लिए एक झुका हुआ शेकर नियोजित किया जा सकता है।
एक साथ लिया गया, कई चयनित तकनीकों का एकीकरण आईपीएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड गठन की एक मजबूत विधि प्रदान करता है। ऑर्गेनोइड्स बनाने और बनाए रखने के कई तरीके हैं, लेकिन उनमें से कई प्रारंभिक भेदभाव प्रक्षेपवक्रों पर ध्यान केंद्रित करते हैं। इस काम में, कई अलग-अलग तकनीकों को विस्तारित अवधि के लिए ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के लिए जोड़ा गया था, भेदभाव चरण से आगे, और परिपक्वता अवधि में जहां उम्र बढ़ने वाले फेनोटाइप विकसित होना शुरू हो सकते हैं। इन तकनीकों को शामिल करने से संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए बहिर्जात जैविक कारकों की आवश्यकता के बिना लंबे समय तक परिपक्वता की अनुमति मिलती है, जो उम्र बढ़ने के आत्म-संगठन और प्राकृतिक प्रगति को बनाए रखता है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को नीदरलैंड ऑर्गन-ऑन-चिप पहल, नीदरलैंड सरकार के शिक्षा, संस्कृति और विज्ञान मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित एक एनडब्ल्यूओ गुरुत्वाकर्षण परियोजना (024.003.001) द्वारा समर्थित किया गया था। डी.सी.बी. डॉक्टरेट छात्रवृत्ति के रूप में कॉन्सेजो नेशनल डी सिएनसिया वाई टेक्नोलोजिया (CONACYT) की वित्तीय सहायता को धन्यवाद देता है।
2-β-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | |
4′,6-Diamidino-2-phenylindoledihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | 1:4000 |
6-well Clear Flat Bottom CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate | Greiner Bio-One | 657185 | |
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Well Plate | Corning | 3471 | |
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Fisher Scientific | 136101 | |
Accutase | Sigma-Aldrich | 46964 | cell detachment solution |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
B27 Suppement (with Vitamin A) (50x) | Gibco | 17504044 | |
B27 Supplement (minus Vitamin A) (50x) | Gibco | 12587010 | |
BD Vacutainer™ Glass Mononuclear Cell Preparation (CPT) Tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-685-125 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | With plate holders |
CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
CytoTune Sendai Reprogramming Vector | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
ddPCR primers | human | MAPT | Bio-Rad | dHsaCPE192234 | |
ddPCR primers | human | RBFOX3 (NeuN) | Bio-Rad | dHsaCPE5052108 | |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
Doublecortin (DCX) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8066 | 1:500 |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | no calcium, no magnesium |
Eppendorf cups, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.215 | |
Essential 6 | Gibco | A1516401 | |
Essential 8 | Gibco | A1517001 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | |
Falcon tubes, 15 mL, conical | Greiner Bio-One | 188271-N | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | 37% Stock solution, diluted to 4% in PBS |
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
GlutaMax (100x) | Gibco | 35050038 | |
Hemacytometer cell counter | Hausser scientific | 1490 | |
HEPES Buffer | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
LDN 193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
MAP2 | Abcam | ab32454 | 1:200 |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356230 | basement membrane matrix |
MEM-Non Essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA; 100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
Multilabel Counter Victor 3 Plate Reader | Perkin Elmer | 1420 | luminometer |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
NeuN | Millipore | MAB377 | 1:500 |
Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
Oct-3/4 Antibody (C-10) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 AF647 | 1:100 |
Parafilm | Bemis | PM-996 | thermoplastic film sheet |
PAX6 | Thermo Fisher Scientific | 42-6600 | 1:200 |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microfilaments | Ethicon | J463 | |
QX200 Droplet digital PCR system | Bio-Rad | 1864001 | |
ROCK inhibitor (Y27632) | Selleck Chemicals | S1049 | |
SB431542 | R&D Systems | 1614/50 | |
SOX2 Monoclonal Antibody (Btjce), Alexa Fluor 488, eBioscience | Invitrogen | 53-9811-80 | 1:100 |
Synapsin I (SYN) | Calbiochem | 574777 | 1:200 |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
TUJ1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-80005 | Beta-3-tubulin; 1:500 |
XAV939 | Tocris Bioscience | 3748 |