Den nåværende protokollen gir en trinnvis prosedyre for reproduserbar generering, vedlikehold og aldring av cerebrale organoider avledet fra humaninduserte pluripotente stamceller (iPSCs). Denne metoden muliggjør dyrking og modning av cerebrale organoider i lengre perioder, noe som letter modelleringen av prosesser involvert i hjernens aldring og aldersrelatert patogenese.
De tilgjengelige dyre- og cellulære modellene rekapitulerer ikke fullt ut kompleksiteten av endringer som finner sted i den aldrende menneskelige hjerne. En nylig utvikling av prosedyrer som beskriver genereringen av humane cerebrale organoider, avledet fra humane induserte pluripotente stamceller (iPSCs), har potensial til å fundamentalt transformere evnen til å modellere og forstå aldring av den menneskelige hjerne og relaterte patogene prosesser. Her presenteres en optimalisert protokoll for generering, vedlikehold, aldring og karakterisering av humane iPSC-avledede cerebrale organoider. Denne protokollen kan implementeres for å generere hjerneorganoider på en reproduserbar måte og fungerer som en trinnvis veiledning, som inneholder de nyeste teknikkene som resulterer i forbedret organoid modning og aldring i kultur. Spesifikke problemer knyttet til organoid modning, nekrose, variabilitet og batcheffekter blir adressert. Samlet sett vil disse teknologiske fremskrittene tillate modellering av hjernens aldring i organoider avledet fra en rekke unge og eldre menneskelige givere, samt personer som er rammet av aldersrelaterte hjernesykdommer, noe som gjør det mulig å identifisere fysiologiske og patogene mekanismer for menneskelig hjerne aldring.
Aldringssykdomsmodeller har blitt stadig mer relevante ettersom menneskets forventede levealder fortsetter å stige. Store genomiske studier har avdekket eldre populasjoner med dysregulering av molekylære prosesser og genetiske endringer som påvirker livskvaliteten1. Aldringsprosessen er preget av et generelt tap av funksjonalitet av organismen, inkludert tap av kognitiv funksjon, økt risiko for neurodegenerative lidelser og en rekke kroniske sykdommer2.
Nåværende cellekulturteknikker representerer ikke hensiktsmessig aldringens multifaktorielle natur, da disse dysfunksjonene ikke kan replikeres riktig ved bruk av mutasjoner, toksiner eller infeksjoner3. Dyremodeller som utforsker aldringsprosessen er ofte forbundet med lange eksperimentelle tider og høye kostnader, men bringer også etiske hensyn med seg. Bruk av induserte pluripotente stamceller (iPSCs) fra pasienter kan belyse de molekylære mekanismene som ligger til grunn for sykdomsprogresjon ettersom iPSCs tillater naturlig utvikling av celler i modent vev3. iPSCs har blitt arbeidshesten til mange laboratorier som undersøker nevrodegenerative lidelser, da den cellulære omprogrammeringen av høstede celler ikke ser ut til å slette sykdommen eller aldringsavtrykkene til giverne4. Disse avtrykkene rekapitulerer cellulære fenotyper som har blitt demonstrert i modeller av mennesker og dyr, noe som gjør iPSCer egnet til å undersøke individuell cellulær forverring av det svært tette hjernevevet 5,6. IPSC-avledede organoider har blitt den fremste modellen for tredimensjonal dyrking av vev, noe som muliggjør mer komplekse celle-til-celle-interaksjoner og en forbedret utviklingsmessig rekapitulasjon. Selv om de primært brukes til utviklingsdata, har organoider i økende grad blitt brukt mot sykdomsmodellering, spesielt modeller for betennelse, nevrodegenerasjon og aldring7. Ved å bygge på tidligere iPSC-studier, beholder organoider sykdomsfenotyper og cellulære fenotyper innenfor den fysiologiske konteksten av vevslignende nettverksforbindelser 8,9. Imidlertid kan dyrking av tredimensjonalt vev av visse dimensjoner være utfordrende, spesielt i lengre perioder.
Dette arbeidet presenterer en detaljert metode for reproduserbar generering av cerebrale organoider som gjør at vevet kan modnes vesentlig i størrelse i lengre perioder. Cerebral organoid opprettelse har forblitt relativt standardisert, ved å ta i bruk metoder fra flere fremtredende protokoller10,11. Det er imidlertid foreslått flere modifikasjoner for forbedret differensiering og vedlikehold. Disse alternative metodene inkluderer bruk av nevrogene faktorer for å forbedre nevral differensiering 12, ekstra stillaser for forbedret næringsutveksling som fremmer cellulær levetid13 og lavren stressagitasjon for langvarig kultur og vekst14. Disse forbedringene har blitt innlemmet i denne metoden for å utvikle modne organoider som er i stand til å uttrykke nevrodegenerative og aldrende fenotyper.
Den standardiserte dannelsen av EB er et kritisk trinn i reproduserbar omdannelse av pluripotente stamceller til hjerneorganoider. Kraftaggregeringen av stamceller i singulært vev kan variere avhengig av geometrien til de konkave brønnene, såtetthet og brønnbehandling. Selv om den nåværende metoden angir et diameterområde på 500-600 μm etter 6 dager, utelukker disse diametrene ikke andre diametre med riktig organoiddannelse, da mange andre diametre har vist seg vellykket. Imidlertid har varierende diametre vist seg å påvirke differensieringsrater og suksess29. For reproduserbarhetsformål anbefales diametervariasjoner under 50 μm sterkt20. I tillegg kan antall nevrale induksjonsdager forlenges fra 6 til 10 dager for å tillate EBs å vokse i diameter, da bruk av SMAD-hemmere har vist seg å effektivt produsere og opprettholde nevroepiteldannelse etter bare 5 dagers eksponering30. I fravær av SMAD-hemmere kan nevral induksjon gi inkonsistente resultater, noe som krever lengre induksjonsperioder. SMAD-hemmere sitert i dette arbeidet er de mest effektive, men andre dorsomorfin og TGF-β små molekyler kan brukes ved effektiv konsentrasjon.
Kjellermembranmatrisen gir et utmerket substrat for vekst og kan administreres annerledes. Tidlig bruk av matrisen inkluderte basalmembranen som et brønnbelegg31. Imidlertid viste bruken av matrisen for innebygging av vev å forbedre differensiering og modning i disse vevene32. For organoider har bruken av matrisen vist seg å forbedre EB-differensiering til organoider, fremme modning og forlenge kulturperioder33. Mens organoider fortsatt kan dannes uten matrisen, da mange grupper har forsøkt å oppnå en matrisefri vevskultur 34,35, har studier funnet at matrise-innebygde organoider har større sjanse for langvarige kulturtider og krever mindre vedlikehold36. Dimple-metoden for innebygging gir lik dekning av organoidoverflaten, noe som sikrer lignende diffusjon, tilgang til næringsstoffer og reproduserbar differensiering. Alternativt kan kuppelinnebygging brukes til å kapsle inn organoidenefullt ut 37.
Overføringen av EB-ene til membranmatrisegropene er et kritisk trinn. Selv om en 1 ml pipettespiss har en bred nok åpning til å overføre EB-ene, foretrekkes en spiss på 200 μL for enkel overføring. De 200 μL-spissene må kuttes for å skape en stor nok åpning, noe som sikrer en jevn kant for å redusere skjærspenningen ved pipettering. Alternativt finnes det brede bore 200 μL spisser for enkel overføring. Pipettering må gjøres langsomt, da rask pipettering kan forstyrre organoidperiferien og hindre riktig vekst. Spesiell oppmerksomhet må tas for å sikre at tilstrekkelig medium overføres for å gi næringsstoffer. For lite medium risikerer å tørke ut organoidet og forårsake nekrose. Overføring av EB med for mye dyrkningsmedium kan føre til at matriksen blir for fortynnet og ikke klarer å kapsle inn organoiden sikkert. Ideelt sett må matriksen ikke fortynnes med mer enn 50% for å sikre polymerisasjon og funksjon som ECM for EB. Hvis innebyggingen mislykkes, kan EB gjenopprettes og kapsles inn på nytt. Re-innkapsling i den friske matrisen kan gjøres når som helst for å gi organoid ekstra støtte.
I likhet med matriseinnbygging for stillas, gir PLGA-fibre ekstra støtte for tredimensjonal vekst. Opprinnelig innlemmet for å produsere langstrakte organoider og øke overflatearealet38, har inkorporering av PLGA-fibre gradvis blitt identifisert som et ekstra verktøy for å forbedre organoid differensiering og modning39. Etter hvert som flere laboratorier ser ut til å redusere bruken av matrisen eller avskaffe den helt, gir de selvorganiserende egenskapene til organoider støttet av de inkorporerte fibrene nok stillas for tredimensjonal vevsopprettelse og differensiering39. Her ble begge metodene kombinert for å øke sjansene for langsiktig kultur38,39. Inkorporering av fibre under den første aggregeringen er kritisk, da disse kanskje ikke blir introdusert på et senere tidspunkt. Etter sentrifugering vil kontroll av at et par fibre er blant de aggregerte cellene sikre at en fiber er innlemmet i EB. Hvis det ikke lykkes, bør en mild aspirasjon av brønnen og re-sentrifugering sikre blanding.
Et annet kritisk skritt i organoid vedlikehold er innføringen av en orbital shaker for bedre media perfusjon. I tidlige iterasjoner av organoidprotokoller ble en spinnende bioreaktor brukt til å skape agitasjon11. En orbital shaker ved 90 o / min gir tilstrekkelig agitasjon uten å ødelegge matriksdråpen eller skade organoid morfologi. Noen grupper avstår fra å bruke matrisestillaset, men beholder shaker-agitasjonen for å gi et passende miljø34. Som med alle protokoller, må rotasjonshastigheten justeres avhengig av risteren for å redusere mengden skjærspenning. Hvis en kuppelinnebygging ble valgt, kunne en skråstilt rister brukes til å redusere mengden skjærspenning11,34.
Til sammen gir integreringen av flere utvalgte teknikker en robust metode for iPSC-avledet organoiddannelse. Det er flere måter å skape og vedlikeholde organoider på, men mange av dem fokuserer på tidlige differensieringsbaner. I dette arbeidet ble flere forskjellige teknikker kombinert for å dyrke organoider i lengre perioder, forbi differensieringsfasen, og inn i en modningsperiode hvor aldrende fenotyper kan begynne å utvikle seg. Innlemming av disse teknikkene muliggjør langvarig modning uten behov for eksogene biologiske faktorer for å opprettholde kulturen, beholde selvorganisasjonen og den naturlige utviklingen av aldring.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Netherlands Organ-on-Chip Initiative, et NWO Gravitation-prosjekt (024.003.001) finansiert av departementet for utdanning, kultur og vitenskap i regjeringen i Nederland. DCB anerkjenner heldigvis den økonomiske støtten fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) i form av et doktorgradsstipend.
2-β-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | |
4′,6-Diamidino-2-phenylindoledihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | 1:4000 |
6-well Clear Flat Bottom CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate | Greiner Bio-One | 657185 | |
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Well Plate | Corning | 3471 | |
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Fisher Scientific | 136101 | |
Accutase | Sigma-Aldrich | 46964 | cell detachment solution |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
B27 Suppement (with Vitamin A) (50x) | Gibco | 17504044 | |
B27 Supplement (minus Vitamin A) (50x) | Gibco | 12587010 | |
BD Vacutainer™ Glass Mononuclear Cell Preparation (CPT) Tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-685-125 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | With plate holders |
CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
CytoTune Sendai Reprogramming Vector | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
ddPCR primers | human | MAPT | Bio-Rad | dHsaCPE192234 | |
ddPCR primers | human | RBFOX3 (NeuN) | Bio-Rad | dHsaCPE5052108 | |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
Doublecortin (DCX) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8066 | 1:500 |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | no calcium, no magnesium |
Eppendorf cups, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.215 | |
Essential 6 | Gibco | A1516401 | |
Essential 8 | Gibco | A1517001 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | |
Falcon tubes, 15 mL, conical | Greiner Bio-One | 188271-N | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | 37% Stock solution, diluted to 4% in PBS |
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
GlutaMax (100x) | Gibco | 35050038 | |
Hemacytometer cell counter | Hausser scientific | 1490 | |
HEPES Buffer | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
LDN 193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
MAP2 | Abcam | ab32454 | 1:200 |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356230 | basement membrane matrix |
MEM-Non Essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA; 100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
Multilabel Counter Victor 3 Plate Reader | Perkin Elmer | 1420 | luminometer |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
NeuN | Millipore | MAB377 | 1:500 |
Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
Oct-3/4 Antibody (C-10) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 AF647 | 1:100 |
Parafilm | Bemis | PM-996 | thermoplastic film sheet |
PAX6 | Thermo Fisher Scientific | 42-6600 | 1:200 |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microfilaments | Ethicon | J463 | |
QX200 Droplet digital PCR system | Bio-Rad | 1864001 | |
ROCK inhibitor (Y27632) | Selleck Chemicals | S1049 | |
SB431542 | R&D Systems | 1614/50 | |
SOX2 Monoclonal Antibody (Btjce), Alexa Fluor 488, eBioscience | Invitrogen | 53-9811-80 | 1:100 |
Synapsin I (SYN) | Calbiochem | 574777 | 1:200 |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
TUJ1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-80005 | Beta-3-tubulin; 1:500 |
XAV939 | Tocris Bioscience | 3748 |