流动蚯蚓法在 秀丽隐 杆线虫肠道微生物组定量分析中的应用
Summary
秀丽隐杆线虫 是一种强大的模型，用于研究驱动宿主-微生物组相互作用的分子决定因素。我们提出了一个高通量管道，分析肠道微生物组定植的单一动物水平以及 秀丽隐杆 线虫生理学的关键方面。
Abstract
肠道微生物组的组成会对动物的整个发育和生命过程中的宿主生理机能产生巨大影响。测量微生物组的组成变化对于确定这些生理变化之间的功能关系至关重要。 秀丽隐杆线虫 已成为一种强大的宿主系统，用于研究宿主-微生物组相互作用的分子驱动因素。凭借其透明的身体计划和荧光标记的天然微生物，可以使用大型颗粒分选机轻松量化单个 秀丽隐杆线虫 动物肠道微生物组内微生物的相对水平。在这里，我们描述了微生物组的实验设置、所需生命阶段线 虫 种群的收集和分析、分选机的操作和维护以及所得数据集的统计分析的程序。我们还讨论了基于目标微生物优化分选机设置的注意事项，为 秀丽隐杆 线虫生命阶段开发有效的门控策略，以及如何利用分选机功能根据肠道微生物组组成丰富动物种群。潜在应用的示例将作为协议的一部分进行介绍，包括扩展到高通量应用的潜力。
Introduction
动物的进化受到微生物的持续影响1.从环境中的各种微生物中，动物宿主获得了特定的伙伴2 ，这些伙伴扩展了宿主的能力并驱动其生理学和对疾病的易感性3。例如，肠道微生物组的宏基因组分析揭示了富含代谢类别的微生物基因，这些基因可能在肥胖小鼠中赋予更大的能量收集和储存4，其中许多也存在于人类肠道微生物组5中。尽管微生物组的复杂性和宿主系统对大规模筛选的可处理性阻碍了进展，但仍然非常需要建立因果关系并确定微生物组影响的分子决定因素。
模式生物秀丽隐杆线虫提供了一个平台，以促进对微生物组和宿主生理学之间联系的分子理解。秀丽隐杆线虫拥有 20 个具有粘膜层和绒毛结构的肠细胞。这些细胞配备了丰富的化学感受器基因，这些基因可以感知微生物产物并产生可能调节其肠道定植者的抗菌分子6,7。秀丽隐杆线虫的这种保守生物学导致了大量调节肠道微生物的宿主信号传导的发现，包括胰岛素信号传导、TGF-β 和 MAP 激酶 8,9,10。
秀丽隐杆线虫在发育过程中利用微生物作为其生长的饮食，并利用成虫的微生物组。随着年龄的增长，一些微生物可能会在肠腔中过度积累，宿主与微生物的关系从共生转变为发病机制11。在它们的自然栖息地中，秀丽隐杆线虫会遇到各种各样的细菌物种12,13。对在自然栖息地（腐烂的水果、植物茎和动物载体）收集的代表性样本进行16S rDNA测序，发现秀丽隐杆线虫的天然微生物组以4个细菌门为主：变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门。 在这些分区中，基于栖息地的细菌多样性和丰富度存在很大差异12,13,14,15。已经建立了几个明确的群落，包括 63 个成员 （BIGbiome）16 和 12 个成员 （CeMbio） 集合，代表了为秀丽隐杆线虫研究社区创建的顶级微生物组属17。微生物组和成分菌株都可以对秀丽隐杆线虫的生理机能产生不同的影响，例如体型、生长速度和应激反应 9,16,17。这些研究为将秀丽隐杆线虫确立为微生物组研究的模型提供了资源和示例。
这里介绍了一个基于大型颗粒分选机（LPS）的工作流程（图1），该工作流程利用 秀丽隐杆线 虫系统在群体规模上同时测量微生物组组成和宿主生理学的基本测量。从微生物方面来看，该工作流程适用于组装定义的微生物组或单个微生物，以测试群落的稳健性和可塑性，并增加微生物相互作用。从宿主侧来看，该工作流程可实现高通量检测，以测量微生物组中荧光微生物的定植水平，并在发育、体型和繁殖方面获得宿主生理读数。综上所述， 秀丽隐杆 线虫微生物组模型能够进行高通量筛选，以确定调节宿主生理学的代谢和遗传决定因素。
Protocol
Representative Results
Discussion
在多项研究中，流式蚯蚓法已被用于表征秀丽隐杆线虫基因和抗病原体定植和毒性的途径21,22。在这里，提出了一种高通量的方法，该方法使用秀丽隐杆线虫来研究肠道微生物组如何调节其宿主生理学。与使用集落形成单位 （CFU） 或 16S rRNA 扩增子测序9、16、17、<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助DP2DK116645（BSS），邓恩基金会飞行员奖和NASA资助80NSSC22K0250（BSS）的支持。该项目还得到了贝勒医学院细胞术和细胞分选核心的支持，并获得了 CPRIT 核心设施支持奖 （CPRIT-RP180672）、NIH（S10 OD025251、CA125123 和 RR024574）的资助，以及 Joel M. Sederstrom 的协助，以及 LPS NIH 资助的仪器资助（S10 OD025251）。一些菌株由CGC提供，CGC由NIH研究基础设施计划办公室（P40 OD010440）资助。
Materials
| 15 mL conical bottom centrifuge tubes | VWR | 10026-076 | |
| 96 deep-well plates (1 mL) | Axygen | P-DW-11-C | |
| 96 deep-well plates (2 mL) | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well Costar plate | Corning | 3694 | |
| Agar | Millipore Sigma | Standard bacteriology agar is also sufficient. | |
| Aspirating manifold | V&P scientific | VP1171A | |
| Bleach | Clorox | ||
| Bleach solution | Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v) | ||
| Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | Cytation 5 | Bacterial OD measurement |
| Centrifuge | Thermo scientific | Sorvall Legend XTR | For 96 well plate and conical tubes |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TiE | |
| ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. | R package | Version 3.3.2 | |
| Large Particle Autosampler | Union Biometrica | LP Sampler | |
| Large Particle Sorter | Union Biometrica | COPAS Biosorter | |
| Levamisole | Fisher | AC187870100 | |
| Lysogeny Broth (LB) | RPI | L24066 | Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient. |
| M9 solution | 22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4 | ||
| Nematode Growth Medium | RPI | N81800-1000.0 | 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving. |
| RStudio | GNU | Version 1.3.1093 | |
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | 5M NaOH | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sterile 10 cm diameter petri dishes | Corning | 351029 | |
| Sterile 12-well plates | VWR | 10062-894 | |
| Sterile 24-well plates | VWR | 10062-896 | |
| Sterile 6 cm diameter petri dishes | Corning | 351007 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
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