Caenorhabditis elegans Bağırsak Mikrobiyomunun Miktar Tayini ve Analizi için Akış Vermimetrisinin Uygulanması
Summary
Caenorhabditis elegans , konakçı-mikrobiyom etkileşimlerini yönlendiren moleküler belirleyicileri incelemek için güçlü bir modeldir. C. elegans fizyolojisinin temel yönleriyle birlikte bağırsak mikrobiyom kolonizasyonunun tek hayvan seviyelerinin profilini çıkaran yüksek verimli bir boru hattı sunuyoruz.
Abstract
Bağırsak mikrobiyomunun bileşimi, hayvanın gelişimi ve yaşamı boyunca konakçı fizyolojisi üzerinde dramatik bir etkiye sahip olabilir. Mikrobiyomdaki bileşimsel değişikliklerin ölçülmesi, bu fizyolojik değişiklikler arasındaki fonksiyonel ilişkilerin belirlenmesinde çok önemlidir. Caenorhabditis elegans , konak-mikrobiyom etkileşimlerinin moleküler itici güçlerini incelemek için güçlü bir konak sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Şeffaf vücut planı ve floresan etiketli doğal mikropları ile, tek bir C. elegans hayvanının bağırsak mikrobiyomundaki nispi mikrop seviyeleri, büyük bir partikül ayırıcı kullanılarak kolayca ölçülebilir. Burada, bir mikrobiyomun deneysel kurulumu, C. elegans popülasyonlarının istenen yaşam evresinde toplanması ve analizi, ayıklayıcının çalıştırılması ve bakımı ve elde edilen veri kümelerinin istatistiksel analizleri için prosedürleri açıklıyoruz. Ayrıca, ilgilenilen mikroplara dayalı olarak sıralayıcı ayarlarını optimize etmeye yönelik hususları, C. elegans yaşam evreleri için etkili geçit stratejilerinin geliştirilmesini ve bağırsak mikrobiyom bileşimine dayalı hayvan popülasyonlarını zenginleştirmek için sıralayıcı yeteneklerinin nasıl kullanılacağını tartışıyoruz. Yüksek verimli uygulamalara ölçeklenebilirlik potansiyeli de dahil olmak üzere protokolün bir parçası olarak potansiyel uygulama örnekleri sunulacaktır.
Introduction
Hayvan evrimi sürekli mikrobiyal etki altındadır1. Çevredeki çeşitli mikroplardan, hayvan konakçıları, konakçının yeteneklerini genişleten ve fizyolojisini ve hastalığa duyarlılığınıartıran belirli ortaklar2 edinir 3. Örneğin, bağırsak mikrobiyomunun metagenomik analizleri, çoğu insan bağırsak mikrobiyomunda 5 bulunan obez farelerde4 daha fazla enerji hasadı ve depolanması sağlayabilecek zenginleştirilmiş metabolik mikrobiyal gen sınıflarını ortayaçıkardı. Nedensel ilişkiler kurmak ve mikrobiyom etkisinin moleküler belirleyicilerini belirlemek için hala büyük bir ihtiyaç vardır, ancak ilerleme, mikrobiyom karmaşıklıkları ve konakçı sistemlerin büyük ölçekli taramaya izlenebilirliği nedeniyle engellenmiştir.
Model organizma C. elegans, mikrobiyom ve konak fizyolojisi arasındaki bağlantıların moleküler olarak anlaşılmasını ilerletmek için bir platform sağlar. C. elegans, mukozal tabaka ve villus yapılarına sahip 20 bağırsak hücresine sahiptir. Bu hücreler, mikrobiyal ürünleri algılayan ve bağırsak kolonizörlerini potansiyel olarak düzenleyen antimikrobiyal moleküller üreten bol miktarda kemoreseptör genleri ile donatılmıştır 6,7. Bu korunmuş biyoloji C. elegans insülin sinyali, TGF-beta ve MAP Kinaz 8,9,10 dahil olmak üzere bağırsak mikroplarını düzenleyen konakçı sinyallemesinde çok sayıda keşfe yol açmıştır.
C. elegans, mikropları hem gelişim sırasında büyüme için diyetleri hem de yetişkinler olarak mikrobiyom olarak kullanır. Yaşlılıkla birlikte, bazı mikroplar bağırsak lümeninde aşırı birikebilir ve konak-mikrop ilişkisi simbiyozdan patogenezegeçer 11. Doğal ortamlarında, C. elegans çok çeşitli bakteri türleriyle karşılaşır12,13. Doğal habitatlarda (çürük meyveler, bitki sapı ve hayvan vektörleri) toplanan temsili örneklerden 16S rDNA’nın dizilenmesi, C. elegans’ın doğal mikrobiyomuna dört bakteri filumunun hakim olduğunu ortaya koydu: Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes ve Actinobacteria. Bu bölümler içinde, habitat 12,13,14,15’e dayalı olarak bakterilerin çeşitliliği ve zenginliğinde büyük farklılıklar vardır. C. elegans araştırma topluluğu17 için oluşturulan en iyi mikrobiyom cinslerini temsil eden 63 üyeli (BIGbiome)16 ve 12 üyeli (CeMbio) koleksiyonları dahil olmak üzere çeşitli tanımlanmış topluluklar oluşturulmuştur. Hem mikrobiyomlar hem de bileşen suşları, vücut büyüklüğü, büyüme oranları ve stres tepkileri gibi C. elegans’ın fizyolojisi üzerinde çeşitli etkilere sahip olabilir 9,16,17. Bu çalışmalar, C. elegans’ı mikrobiyom araştırmaları için bir model olarak kurmak için kaynaklar ve örnekler sağlar.
Burada, popülasyon ölçeğinde mikrobiyom bileşimini ve konakçı fizyolojisinin temel ölçümlerini aynı anda ölçmek için C. elegans sistemini kullanan büyük partikül sıralayıcı (LPS) tabanlı bir iş akışı (Şekil 1) sunulmaktadır. Mikrobiyal açıdan, iş akışı, artan mikrobiyal etkileşimlerle topluluğun sağlamlığını ve plastisitesini test etmek için tanımlanmış bir mikrobiyomu veya tek mikropları bir araya getirmek için uyarlanabilir. Konakçı tarafında, iş akışı, mikrobiyomdaki floresan mikropların kolonizasyon seviyelerini ölçmek ve gelişim, vücut büyüklüğü ve üreme açısından konakçı fizyolojik okumasını sağlamak için yüksek verimli tahliller sağlar. Birlikte ele alındığında, C. elegans mikrobiyom modeli, konakçı fizyolojisini modüle eden metabolik ve genetik belirleyicileri saptamak için yüksek verimli ekranlar sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Akış vermimetrisi, çeşitli çalışmalarda C. elegans genlerini ve patojen kolonizasyonuna ve toksisitesine karşı yolakları karakterize etmek için kullanılmıştır21,22. Burada, bağırsak mikrobiyomlarının konakçı fizyolojisini nasıl modüle ettiğini araştırmak için C. elegans’ı kullanan yüksek verimli bir yaklaşım sunulmaktadır. Koloni oluşturan birimler (CFU) veya 16S rRNA amplikon dizilimi 9,16,17,23,24 k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, NIH hibeleri DP2DK116645 (BSS’ye), Dunn Vakfı pilot ödülü ve NASA hibesi 80NSSC22K0250 (BSS’ye) tarafından desteklenmiştir. Bu proje aynı zamanda Baylor Tıp Fakültesi’ndeki Sitometri ve Hücre Sıralama Çekirdeği tarafından CPRIT Çekirdek Tesis Destek Ödülü (CPRIT-RP180672), NIH (S10 OD025251, CA125123 ve RR024574) ve Joel M. Sederstrom’un yardımı ve ayrıca LPS NIH hibesi (S10 OD025251) için bir enstrümantasyon hibesi. Bazı suşlar, NIH Araştırma Altyapısı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlanmıştır.
Materials
| 15 mL conical bottom centrifuge tubes | VWR | 10026-076 | |
| 96 deep-well plates (1 mL) | Axygen | P-DW-11-C | |
| 96 deep-well plates (2 mL) | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well Costar plate | Corning | 3694 | |
| Agar | Millipore Sigma | Standard bacteriology agar is also sufficient. | |
| Aspirating manifold | V&P scientific | VP1171A | |
| Bleach | Clorox | ||
| Bleach solution | Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v) | ||
| Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | Cytation 5 | Bacterial OD measurement |
| Centrifuge | Thermo scientific | Sorvall Legend XTR | For 96 well plate and conical tubes |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TiE | |
| ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. | R package | Version 3.3.2 | |
| Large Particle Autosampler | Union Biometrica | LP Sampler | |
| Large Particle Sorter | Union Biometrica | COPAS Biosorter | |
| Levamisole | Fisher | AC187870100 | |
| Lysogeny Broth (LB) | RPI | L24066 | Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient. |
| M9 solution | 22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4 | ||
| Nematode Growth Medium | RPI | N81800-1000.0 | 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving. |
| RStudio | GNU | Version 1.3.1093 | |
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | 5M NaOH | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sterile 10 cm diameter petri dishes | Corning | 351029 | |
| Sterile 12-well plates | VWR | 10062-894 | |
| Sterile 24-well plates | VWR | 10062-896 | |
| Sterile 6 cm diameter petri dishes | Corning | 351007 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).
- Seedorf, H., et al. Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut. Cell. 159 (2), 253-266 (2014).
- Bäckhed, F., et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
- Gill, S. R., et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science. 312 (5778), 1355-1359 (2006).
- Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).
- Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), 1921 (2003).
- Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).
- Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
- Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
- Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
- Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).
- Dirksen, P., et al. CeMbio – The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3. 10 (9), 3025-3039 (2020).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
- R Core. Team R: A language and environment for statistical computing. R Core. , (2018).
- Wickham, H., et al. . tidyverse. , (2019).
- Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
- Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments. (85), e51090 (2014).
- Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiology. 12 (1), 49 (2012).
- Zhang, F., et al. High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome. Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).
- Wiles, T. J., et al. Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages. mBio. 9 (5), 01877 (2018).
- Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ. Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).
- Leonard, S. P., et al. Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
- Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).
- Mok, C. A., et al. MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes. Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).
