तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा आंसू प्रोटिओमिक्स के लिए एक प्रोटीन सस्पेंशन-ट्रैपिंग नमूना तैयारी
Summary
यह प्रोटोकॉल शिमर स्ट्रिप्स का उपयोग करके आंसू के नमूने एकत्र करने की एक विधि और गैर-इनवेसिव टियर प्रोटीन बायोमार्कर की खोज के लिए एक एकीकृत मात्रात्मक वर्कफ़्लो का वर्णन करता है। सस्पेंशन ट्रैपिंग नमूना तैयारी वर्कफ़्लो तेज और मजबूत आंसू नमूना तैयारी और मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण को सक्षम बनाता है, जिसके परिणामस्वरूप मानक इन-सॉल्यूशन प्रक्रियाओं की तुलना में उच्च पेप्टाइड रिकवरी पैदावार और प्रोटीन की पहचान होती है।
Abstract
आंसू द्रव आसानी से सुलभ बायोफ्लुइड्स में से एक है जिसे गैर-आक्रामक रूप से एकत्र किया जा सकता है। आंसू प्रोटिओमिक्स में कई ओकुलर रोगों और स्थितियों के लिए बायोमार्कर की खोज करने की क्षमता है। सस्पेंशन ट्रैपिंग कॉलम को डाउनस्ट्रीम प्रोटिओमिक विश्लेषण के व्यापक अनुप्रयोग के लिए एक कुशल और उपयोगकर्ता के अनुकूल नमूना तैयारी वर्कफ़्लो बताया गया है। फिर भी, मानव आंसू प्रोटिओम के विश्लेषण में इस रणनीति का अच्छी तरह से अध्ययन नहीं किया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके गैर-इनवेसिव टियर प्रोटीन बायोमार्कर अनुसंधान के लिए नैदानिक मानव आंसू नमूनों से शुद्ध पेप्टाइड्स तक एक एकीकृत वर्कफ़्लो का वर्णन करता है, जो जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के साथ संयुक्त होने पर रोग बायोमार्कर और निगरानी में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। एक प्रोटीन सस्पेंशन ट्रैपिंग नमूना तैयारी लागू की गई थी और मानव आंसू द्रव विश्लेषण के लिए एक सार्वभौमिक, अनुकूलित नमूना तैयारी के रूप में तेज, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और उपयोगकर्ता के अनुकूल प्रक्रियाओं के साथ आंसू प्रोटिओम की खोज का प्रदर्शन किया गया था। विशेष रूप से, सस्पेंशन ट्रैपिंग प्रक्रिया ने पेप्टाइड रिकवरी, प्रोटीन पहचान और कम नमूना तैयारी समय के मामले में समाधान नमूना तैयारी से बेहतर प्रदर्शन किया।
Introduction
आंसू प्रोटिओमिक्स ने ओकुलर रोगों और स्थितियों 1,2,3,4,5,6 के लिए संभावित बायोमाकर्स का पता लगाने के लिए ध्यान आकर्षित किया है, ओकुलर और प्रणालीगत स्थिति के रोगजनन तक पहुंचने के लिए, साथ ही शिमर स्ट्रिप्स का उपयोग करके गैर-इनवेसिव आंसू नमूना संग्रह के लाभ का फायदा उठाने के लिए। अगली पीढ़ी के मास स्पेक्ट्रोमेट्री की तकनीकी प्रगति ने सटीकता और परिशुद्धता के साथ माइक्रोलिटर-स्केल आंसुओं में प्रोटीन परिमाणीकरण को सक्षम किया है जो अतीत में संभव नहीं था। नमूना तैयार करने के तरीके अभी तक मानकीकृत नहीं हैं। आंसू प्रोटीन बायोमार्कर अनुसंधान में नैदानिक अनुप्रयोग की सफलता के लिए एक मजबूत और मानकीकृत नमूना तैयारी वर्कफ़्लो आवश्यक है। सस्पेंशन ट्रैपिंग (एस-ट्रैप) नमूना तैयारी वर्कफ़्लो को हाल ही में व्यापक डाउनस्ट्रीम प्रोटिओमिक विश्लेषण 7,8 के लिए एक प्रभावी और संवेदनशील नमूना तैयारी विधि के रूप में रिपोर्ट किया गया था। फिर भी, इस रणनीति को मानव आंसू प्रोटिओम के विश्लेषण में अच्छी तरह से रिपोर्ट नहीं किया गया है, एंजाइमेटिक पाचन दक्षता और मास स्पेक्ट्रोमेट्रिकविश्लेषण द्वारा प्रोटीन की पहचान की अधिक संख्या के संदर्भ में फिल्टर-एडेड नमूना तैयारी (एफएएसपी) और इन-सॉल्यूशन पाचन से बेहतर प्रदर्शन किया है। एस-ट्रैप-आधारित दृष्टिकोण रेटिना ऊतक 10, फॉर्मेलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) ऊतक 11, कोशिका 12, सूक्ष्मजीव 13, और तरल बायोप्सी 14,15 की तैयारी में प्रदर्शित किया गया था।
यह प्रोटोकॉल एक तीव्र, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मजबूत तकनीकी रणनीति के साथ एक गैर-इनवेसिव आंसू प्रोटीन बायोमार्कर पैनल की खोज के लिए नैदानिक नमूनों से एंजाइमेटिक रूप से पचने वाले प्रोटीन तक एक एकीकृत मात्रात्मक वर्कफ़्लो का वर्णन करता है। संक्षेप में, आंसू द्रव को एक मानक शिमर पट्टी का उपयोग करके एकत्र किया गया था और कमरे के तापमान पर प्रोटीन ऑटोलिसिस को रोकने के लिए तुरंत एक नेत्र फ्रेम हीटर के साथ सुखाया गया था। निर्माता के सुझाव के अनुसार 5% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) लाइसिस बफर का उपयोग करके एम्बेडेड कुल प्रोटीन निकाले गए थे, इसके बाद प्रोटीन परख माप था। निकाले गए लाइसेट को तब डिथियोथ्रेइटोल (डीटीटी) के साथ मानक कमी और आयोडोसिटामाइड (आईएए) के साथ अल्काइलेशन से गुजरना पड़ा।
फॉस्फोरिक एसिड के साथ अम्लीकरण के बाद, सस्पेंशन ट्रैपिंग कॉलम प्रोटीन वर्षा बफर जिसमें 90% मेथनॉल और 100 एमएम ट्राइथाइलअमोनियम बाइकार्बोनेट (टीईएबी) शामिल थे, को कुल प्रोटीन में जोड़ा गया था। नमूना तब एक नए निलंबन ट्रैपिंग माइक्रो कॉलम में स्थानांतरित किया गया था। एंजाइमेटिक पाचन 1 घंटे के लिए 47 डिग्री सेल्सियस पर 1: 25 अनुपात (डब्ल्यू / डब्ल्यू, ट्रिप्सिन: प्रोटीन) पर अनुक्रमण ग्रेड ट्रिप्सिन के साथ किया जाता है। परिणामी पेप्टाइड्स को तब सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से संश्लेषित किया गया था, क्रमिक रूप से 50 एमएम टीईएबी, 0.2% जलीय फॉर्मिक एसिड (एफए), और 50% एसिटोनिट्राइल (एसीएन) जिसमें 0.2% एफए था। इल्यूटेड पेप्टाइड्स को वैक्यूम-सुखाया गया और 0.1% एफए में पुनर्गठित किया गया। मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण के लिए पेप्टाइड एकाग्रता को मापा गया और 0.5 μg / μL में समायोजित किया गया।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस विधि का उपयोग करके सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए, नमूना संदूषण से बचने के लिए आंसू नमूना संग्रह से सभी प्रक्रियाओं में बिजली मुक्त डिस्पोजेबल दस्ताने पहने जाने चाहिए। माइक्रो-स्पिनिंग कॉलम का उपयोग करके प्रत्येक चरण में फिल्टर और नमूना समाधान के बीच बुलबुले और हवा के अंतराल से बचना महत्वपूर्ण है। यदि नमूना मात्रा स्तंभों की क्षमता से बड़ी है, तो प्रक्रिया को दोहराने की सिफारिश की जाती है। यह प्रोटोकॉल तैयारी के समय, प्रोटीन वसूली और कुल प्रोटीन पहचान के मामले में पारंपरिक इन-सॉल्यूशन प्रोटोकॉल की तुलना में अधिक कुशल साबित हुआ है। यह काफी हद तक है क्योंकि नमूने एक ही कॉलम पर अधिकांश आवश्यक प्रक्रियाओं से गुजरते हैं, इन-सॉल्यूशन विधि के विपरीत जिसमें एसीटोन वर्षा, पाचन और सफाई (डीसॉल्टिंग) जैसे कई स्थानांतरण चरण शामिल होते हैं, जिससे परिणामी डेटा में भिन्नता की संभावना बढ़ जाती है।
माइक्रोकेशिका विधि16,17 के साथ एकत्र किए गए आंसू नमूनों के अलावा, निलंबन-ट्रैपिंग माइक्रो कॉलम के साथ यह एफएएसपी वर्कफ़्लो एक वैकल्पिक नमूना तैयारी विधि प्रदान करता है जो न्यूनतम सामग्री तैयारी और उपयोगकर्ता के अनुकूल चरणों के साथ शिमर स्ट्रिप्स का उपयोग करके एकत्र किए गए तेज और मजबूत आंसू नमूना तैयारी की अनुमति देता है। यह इन-सॉल्यूशन प्रक्रियाओं पर एमएस द्वारा बेहतर पेप्टाइड रिकवरी और प्रोटीन पहचान के साथ कई ओकुलर रोगों या स्थितियों में बड़े कॉहोर्ट अध्ययनों के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य आंसू नमूना तैयार करने की अनुमति देता है। इस विश्वसनीय प्रक्रिया का उपयोग अनुसंधान और अन्य नैदानिक उद्देश्यों के लिए आंसू बायोमार्कर नमूने की तैयारी में नियमित रूप से किया जा सकता है। सबसे महत्वपूर्ण बात, इसे ऑन-साइट संग्रह के लिए न्यूनतम कर्मचारी प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है और फ्रीजर में नमूना भंडारण की आवश्यकता को नकारता है। प्रोटीन ऑटोलिसिस और गिरावट को कम करने के लिए नमूने को ऑनसाइट सुखाया जाता है। इसलिए, यह माइक्रो-केशिका ट्यूबों का उपयोग करने के विपरीत, डाउनस्ट्रीम विश्लेषण की सुविधा के लिए मेल द्वारा सुविधाजनक शिपमेंट की अनुमति देता है।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को इनोएचके पहल और हांगकांग विशेष प्रशासनिक क्षेत्र सरकार द्वारा समर्थित किया गया था; शार्प विजन के लिए अनुसंधान केंद्र; और हांगकांग पॉलिटेक्निक विश्वविद्यालय में चीनी चिकित्सा नवाचार (आरसीएमआई) के लिए अनुसंधान केंद्र।
Materials
| 9 mm Plastic Screw Thread Vials | Thermo Scientific | C4000-11 | |
| Acetonitrile, LCMS Grade | Anaqua | AC-1026 | |
| Centrifuge MiniSpin plus | Eppendorf | 5453000097 | |
| DL-dithiothreitol (DTT), BioUltra | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Formic acid, ACS reagent, ≥96% | Sigma-Aldrich | 695076 | |
| Frame Heater OPTIMONSUN Electronic | Breitfeld & Schliekert GmbH | 1203166 | |
| Iodoacetamide (IAA), BioUltra | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol, HPLC Grade | Anaqua | MA-1292 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes, 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 368632 | |
| Phosphoric acid, 85 wt.% in H2O | Sigma-Aldrich | 345245 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry | Sciex | TripleTOF 6600 | |
| Schirmer Ophthalmic Strips | Entod Research Cell UK Ltd | I-DEW Tearstrips | |
| S-Trap Micro Column | Protifi | C02-micro-80 | |
| SureSTART 9 mm Screw Caps | Thermo Scientific | CHSC9-40 | |
| Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M | Sigma-Aldrich | 18597 | |
| Ultra-performance Liquid Chromatography | Eksigent | NanoLC 400 | |
| UltraPure Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 |
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