Kultur og billeddannelse af ex vivo organotypiske pseudomyxoma peritonei tumorskiver fra resekterede humane tumorprøver

Summary

Vi beskriver en protokol for produktion, kultur og visualisering af humane kræftformer, som har metastaseret til peritoneale overflader. Resected tumorprøver skæres ved hjælp af et vibratomt og dyrkes på permeable indsatser for øget iltning og levedygtighed, efterfulgt af billeddannelse og nedstrømsanalyser ved hjælp af konfokal mikroskopi og flowcytometri.

Abstract

Pseudomyxoma peritonei (PMP) er en sjælden tilstand, der skyldes spredning af en mucinøs primær tumor og den resulterende ophobning af mucinudskillende tumorceller i bughulen. PMP kan opstå fra forskellige typer kræftformer, herunder appendiceal, ovarie og kolorektal, selvom appendiceal neoplasmer er langt den mest almindelige ætiologi. PMP er udfordrende at studere på grund af dets (1) sjældenhed, (2) begrænsede murinmodeller og (3) mucinøs, acellulær histologi. Metoden, der præsenteres her, tillader visualisering og forhør i realtid af disse tumortyper ved hjælp af patientafledte ex vivo organotypiske skiver i et præparat, hvor tumormikromiljøet (TME) forbliver intakt. I denne protokol beskriver vi først forberedelsen af tumorskiver ved hjælp af et vibratomt og efterfølgende langsigtet kultur. For det andet beskriver vi konfokal billeddannelse af tumorskiver og hvordan man overvåger funktionelle aflæsninger af levedygtighed, calciumbilleddannelse og lokal spredning. Kort sagt er skiver fyldt med billedfarvestoffer og placeres i et billeddannelseskammer, der kan monteres på et konfokalmikroskop. Time-lapse-videoer og konfokale billeder bruges til at vurdere den oprindelige levedygtighed og cellulære funktionalitet. Denne procedure undersøger også translationel cellulær bevægelse og parakrin signalinteraktion i TME. Endelig beskriver vi en dissociationsprotokol for tumorskiver, der skal bruges til flowcytometrianalyse. Kvantitativ flowcytometrianalyse kan anvendes til terapeutisk test fra bænk til seng for at bestemme ændringer, der forekommer i immunlandskabet og epitelcelleindholdet.

Introduction

Pseudomyxoma peritonei (PMP) er sjældent syndrom med en forekomst på 1 pr. Million mennesker om året¹. De fleste PMP-tilfælde er forårsaget af metastaser fra appendiceale neoplasmer. I betragtning af at mus ikke har et menneskelignende appendiks, er modellering af denne type kræft fortsat ekstremt udfordrende. Mens den primære sygdom ofte kan helbredes ved kirurgisk resektion, er behandlingsmulighederne for metastatisk sygdom begrænsede. Derfor er begrundelsen for at udvikle denne nye organotypiske skivemodel at studere patobiologien af PMP. Til dato er der ingen appendiceal organoidmodeller, der kan dyrkes evigt; Imidlertid viste en nylig model sig at være nyttig til farmakologisk test af terapeutiske midler og immunterapi². Som sådan har vi tilpasset et organotypisk skivekultursystem, som er blevet brugt i andre typer humane kræftformer, såsom hjerne, bryst, bugspytkirtel, lunge, æggestokke og andre 3,4,5,6.

Ud over appendiceal neoplasmer skyldes PMP lejlighedsvis andre tumortyper, herunder kræft i æggestokkene⁷, og i sjældne tilfælde intraduktale papillære mucinøse neoplasmer⁸ og tyktarmskræft⁹. Derudover har disse tumorer tendens til at vokse langsomt med dårlige engrafthastigheder i patientafledte xenograft (PDX) modeller^10,11. I betragtning af disse udfordringer er der et uopfyldt behov for at udvikle modeller til at studere denne sygdom for at begynde at forstå patobiologien af PMP, og hvordan disse kræftceller: rekrutteres til peritoneale overflader, spredes og undslipper immunovervågning.

Mens skåret fra den systemiske vaskulære cirkulation, tumorskiver indeholder cellulære og acellulære komponenter, herunder den ekstracellulære matrix, stromale celler, immunceller, kræftceller, endotelceller og nerver. Dette semi-intakte mikromiljø giver mulighed for funktionel undersøgelse af disse celletyper, hvilket er unikt fordelagtigt sammenlignet med 3D-organoidkulturer, som kun består af kræftceller¹². Mens organotypiske skivekulturer er fordelagtige i nogle henseender, er de også i sagens natur en tilgang med lav gennemstrømning sammenlignet med 3D-organoider, som kan udvides og er egnede til multiplekset terapeutisk forsøgslægemiddelscreening^13,14,15. I tilfældet PMP har der ikke været rapporter, der dokumenterer pålidelig etablering og evig overførsel af PMP-afledte organoider¹⁶. Dette skyldes sandsynligvis den langsomt voksende karakter af PMP-afledte tumorceller samt det lave antal maligne epitelceller, der findes inden for disse mucinøse tumorer. I betragtning af behovet for at udvikle modeller til undersøgelse af PMP er organotypiske skiver unikt egnet til at studere denne sygdom. Vi præsenterer en protokol til forberedelse, billeddannelse og analyse af PMP fra humane prøver.

Protocol

Deidentifikation og erhvervelse af alt væv blev udført under en IRB-godkendt protokol ved University of California, San Diego. 1. Fremstilling af humant PMP-væv til vævsbehandling og -dyrkning Transport af tumorvæv og mikrodissektionForbered transport- og kulturmediet: Udfyld 10% (v / v) Dulbeccos modificerede ørnemedier (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1% penicillin / streptomycin (Pen Strep). Ved vævets ankomst og i henhold til en institu…

Representative Results

Kort sagt opnås humane tumorprøver fra PMP under en IRB-godkendt protokol. Vævet fremstilles, mikrodissekeres og størkner i en agaroseform, der skal skæres ved hjælp af et vibratomt (figur 1A; Video 1). Når de er skåret, placeres vævsskiver og dyrkes på permeable indsatsmembraner (figur 1B), som kan bruges til billeddannelsesassays in situ såvel som til cellulære og funktionelle forhør ved hjælp af flowcytometri, konfokal …

Discussion

Dette manuskript beskriver en teknik, der kan bruges til at dyrke, forhøre og analysere humane pseudomyxoma peritonei (PMP) tumorprøver. Vi har brugt adskillige downstream funktionelle assays til at forhøre tumorimmunmikromiljøet og en platform til bench-to-bedside test.

Mens metoden er yderst effektiv i vores hænder, vil det kræve en vis øvelse at skære tumorprøver ved hjælp af et vibraatom. Vi stødte nemlig på problemer, der skyldtes meget mucinøse prøver, samt prøver, der fej…

Materials

1 M CaCl2 solution	Sigma	21115
1 M HEPES solution	Sigma	H0887
1 M MgCl2 solution	Sigma	M1028
100 micron filter	ThermoFisher	22-363-549
22 x 40 glass coverslips	Daiggerbrand	G15972H
3 M KCl solution	Sigma	60135
5 M NaCl solution	Sigma	S5150
ATPγS	Tocris	4080
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
Calcein-AM	Invitrogen	L3224
CD11b	Biolegend	101228
CD206	Biolegend	321140
CD3	Biolegend	555333
CD4	Biolegend	357410
CD45	Biolegend	304006
CD8	Biolegend	344721
CellTiter-Glo	Promega	G9681
DMEM	Thermo Fisher	11965084
DPBS	Sigma Aldrich	D8537
FBS, heat inactivated	ThermoFisher	16140071
Fc-block	BD Biosciences	564220
Fluo-4	Thermo Fisher	F14201
Gentle Collagenase/Hyaluronidase	Stem Cell	7912
Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26
Imaging Chamber Platform	Warner Instruments	PH-1
LD-Blue	Biolegend	L23105
L-Glutamine 200 mM	ThermoFisher	25030081
LIVE/DEAD imaging dyes	Thermofisher	R37601
Nikon Ti microscope	Nikon		Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096×4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.
Peristaltic pump	Isamtec	ISM832C
Propidium Iodide	Invitrogen	L3224
Vacuum silicone grease	Sigma	Z273554-1EA