Настоящий протокол описывает возможности и основные методы культивирования органа-чипа с открытым верхом для успешного создания и созревания полнослойных культур первичных тканей (кожи, альвеол, дыхательных путей и кишечника), что дает возможность исследовать различные функциональные аспекты интерфейса эпителия/мезенхимы и сосудистой ниши человека in vitro.
Почти все органы человека выстланы эпителиальными тканями, состоящими из одного или нескольких слоев плотно связанных клеток, организованных в трехмерные (3D) структуры. Одной из основных функций эпителия является формирование барьеров, защищающих подкладные ткани от физических и химических воздействий и инфекционных агентов. Кроме того, эпителий опосредует транспортировку питательных веществ, гормонов и других сигнальных молекул, часто создавая биохимические градиенты, которые определяют позиционирование и компартментализацию клеток в органе. Благодаря своей центральной роли в определении структуры и функции органов, эпителии являются важными терапевтическими мишенями для многих заболеваний человека, которые не всегда фиксируются на животных моделях. Помимо очевидных видовых различий, проведение научных исследований барьерной функции и транспортных свойств эпителия у животных еще больше усугубляется трудностью доступа к этим тканям в живой системе. В то время как двумерные (2D) клеточные культуры человека полезны для ответа на основные научные вопросы, они часто дают плохие прогнозы in vivo . Чтобы преодолеть эти ограничения, в последнее десятилетие появилось множество микроинженерных биомиметических платформ, известных как органы на чипе, в качестве многообещающей альтернативы традиционным испытаниям in vitro и испытаниям на животных. Здесь мы описываем Open-Top Organ-Chip (или Open-Top Chip), платформу, предназначенную для моделирования органоспецифических эпителиальных тканей, включая кожу, легкие и кишечник. Этот чип предлагает новые возможности для восстановления многоклеточной архитектуры и функции эпителиальных тканей, включая возможность воссоздания 3D-стромального компонента путем включения тканеспецифических фибробластов и эндотелиальных клеток в механически активную систему. Этот чип с открытым верхом представляет собой беспрецедентный инструмент для изучения эпителиальных/мезенхимальных и сосудистых взаимодействий в различных масштабах разрешения, от отдельных клеток до многослойных тканевых конструкций, что позволяет молекулярно рассекать межклеточные перекрестные помехи эпителизированных органов в здоровье и при болезнях.
Исторически сложилось так, что ученые полагались на доклинические испытания на животных для открытия лекарств, но все большее число этих методов ставится под сомнение из-за плохой корреляции с человеческим исходом1. Внедрение принципов «3R» для замены, сокращения и уточнения экспериментов на животных побуждает ученых искать новые альтернативные методы in vitro для поддержки доклинической оценки риска лекарственной и химической токсикологии2. Однако многим моделям in vitro, разработанным на сегодняшний день, не хватает биологической архитектуры, клеточной сложности и механической среды, необходимых для повторения динамической природы живых органов человека 3,4.
Обычные доклинические системы in vitro обычно используют 2D-монокультуры клеток человека, выращенных на жесткой пластиковой поверхности. Эти методы обеспечивают инструмент для проведения простых механистических исследований и позволяют быстро проводить скрининг кандидатов на лекарства. Из-за их относительно низкой стоимости и высокой надежности 2D-модели часто сочетаются с автоматическими высокопроизводительными системами и используются для быстрой идентификации потенциальных кандидатов на лекарства на ранней стадии процесса разработки лекарств 5,6. Однако такие 2D-модели не обеспечивают трансляционного подхода к моделированию на тканевом, органном или системном уровне ответов на терапевтические кандидаты, что необходимо для точного прогнозирования безопасности и эффективности лекарственных средств на доклинической стадии их разработки. Плоскоклеточные культуры не повторяют микроокружение нативной ткани, включая сложное многоклеточное взаимодействие, биомеханические свойства и трехмерную (3D) архитектуру тканей человека7. Клетки, растущие на плоской поверхности, часто не приобретают зрелого фенотипа и, следовательно, не могут реагировать на фармакологические раздражители так, как в нативной ткани. Например, первичные альвеолярные эпителиальные клетки человека, выращенные in vitro, проявляют плоскоклеточный фенотип и теряют ключевые фенотипические маркеры, включая сурфактантные белки C и B (SP-C и SP-B)8. В дополнение к недостаточной дифференцировке первичные клетки часто становятся нечувствительными к биологическим стрессорам in vitro, поскольку определенные биохимические пути, связанные с воспалением тканей, становятся нефункциональными9. Такая потеря функции клеток, по-видимому, в первую очередь связана с использованием жестких субстратов, а также с отсутствием растворимых факторов, естественным образом высвобождаемых тканеспецифическими стромальными клетками, такими как фибробласты легких и гладкомышечные клетки10,11.
Понимание того, что отсутствие химиофизической и биологической сложности ограничивает физиологическое поведение клеток in vitro, способствовало разработке более сложных многоклеточных моделей, которые, как оказалось, лучше отражают сложность тканей человека вне тела12,13. С момента создания первых моделей совместной культуры в начале 1970-х годов14 внедрение синтетических и натуральных гидрогелей значительно улучшило способность имитировать микроокружение нативных тканей и стало бесценным инструментом для стимулирования клеточной дифференцировки, направления самоорганизации клеток в тканеподобные структуры и восстановления функций нативных тканей15,16. Например, при выращивании в соответствующем 3D-каркасе клетки человека могут самостоятельно организовываться в функциональные структуры, такие как сфероиды или органоиды, экспрессирующие маркеры стволовых клеток, и способны к самообновлению17. Напротив, клетки человека (включая стволовые клетки) при выращивании на традиционных 2D-субстратах быстро стареют и стареют после нескольких пассажей18. Кроме того, гидрогели могут быть «адаптированы» в соответствии с конкретными свойствами ткани, такими как пористость, размер пор, толщина волокна, вязкоупругость, топография и жесткость, или дополнительно сконструированы с использованием клеточных компонентов тканевого происхождения и/или биологически активных молекул, позволяющих имитировать физиологические или патологические состояния19,20. Несмотря на огромный потенциал для тестирования лекарств, 3D-модели на основе гидрогеля, используемые в фармацевтических исследованиях, не полностью повторяют сложную цитоархитектографию тканей in vivo и не имеют важных гемодинамических и механических стимулов, обычно присутствующих в организме человека, включая гидростатическое давление, циклическое растяжение и сдвиг жидкости21.
Микрофизиологические системы (МПС), такие как органы-на-чипах (OOC), недавно появились как инструменты, способные улавливать сложные физиологические реакции in vitro22,23. В этих моделях часто используются микрофлюидные платформы, которые позволяют моделировать динамическое микроокружение живых органов.
Мы объединили принципы 3D-биоинженерии тканей и механобиологии для создания модели сложной эпителиальной ткани человека с открытым верхом. Это позволило нам точно повторить многоклеточное и динамическое микроокружение эпителиальных тканей. Это включает в себя тканеспецифические биохимические и биомеханические сигналы, естественным образом присутствующие в живых органах, но часто игнорируемые традиционными моделями in vitro 24. Чип с открытым верхом включает в себя два отсека: сосудистый отсек (рис. 1А) и стромальный компартмент (рис. 1В), разделенные пористой мембраной, обеспечивающей диффузию питательных веществ между двумя камерами (рис. 1С). Сосудистый компартмент подвергается непрерывному потоку жидкости для повторения физиологического напряжения сдвига, в то время как растяжимая конструкция стромальной камеры позволяет моделировать механическое напряжение, связанное с дыхательными движениями или перистальтикой кишечника. В стромальном отсеке находится настраиваемый 3D-гидрогелевый каркас, предназначенный для поддержки физиологического роста тканеспецифических фибробластов. Он обладает съемной крышкой, которая облегчает установление границы раздела воздух-жидкость, что позволяет лучше имитировать физиологию тканей слизистой оболочки человека, а также прямой доступ к ткани для введения лекарств непосредственно на эпителиальный слой. На дополнительном рисунке 1 показаны некоторые ключевые компоненты конструкции микросхемы с открытым верхом, включая размеры и биологические отсеки (дополнительный рисунок 1A-D), а также основные технические этапы, описанные в этом протоколе (дополнительный рисунок 1E).
Перфузия чипа с открытым верхом достигается с помощью программируемого перистальтического насоса (рис. 1D). Перистальтический насос позволяет одновременно перфузировать 12 стружек с открытым верхом. Большинство инкубаторов могут содержать две установки, позволяющие выращивать до 24 чипов на инкубатор. Механическое растяжение достигается с помощью специально разработанного программируемого регулятора давления вакуума (рис. 1E). Он состоит из электропневматического регулятора вакуума, управляемого электронным способом цифро-аналоговым преобразователем. Другими словами, электропневматический регулятор вакуума генерирует синусоидальный вакуумный профиль с амплитудой и частотой, которые определяются пользователем. Циклическая деформация в диапазоне от 0% до 15% создается путем приложения отрицательного давления к вакуумному каналу микросхемы с открытым верхом с амплитудой от 0 до -90 кПа и частотой 0,2 Гц. Это специально разработанная система, эквивалентная коммерчески доступному блоку деформации Flexcell, ранее принятому и описанному в других документах25. Чтобы имитировать механическую деформацию ткани, связанную, например, с дыхательным движением легкого или перистальтикой кишечника, пневматический привод применяет синусоидальные волны вакуума/деформации, величина и амплитуда которых могут быть отрегулированы в соответствии с физиологическим уровнем напряжения и частотой, которые клетки человека испытывают в своих родных тканях.
Здесь мы описываем эффективный и воспроизводимый метод разработки и культивирования органотипических эквивалентов эпителия на прототипе платформы Open-Top Chip. Он позволяет создавать сложные модели органов, таких как кожа, альвеолы, дыхательные пути и толстая кишка, интегрируя поток сосудистой жидкости и механическое растяжение. Мы обозначим ключевые технические аспекты, которые необходимо учитывать при реализации принципов тканевой инженерии для создания сложных эпителиальных моделей. Мы обсудим преимущества и возможные ограничения текущей конструкции.
Обзор основных этапов, используемых для достижения созревания тканей и органов, включая параметры потока и растяжения, представлен в: Рисунок 2 для кожи, Рисунок 3 для альвеолы, Рисунок 4 для дыхательных путей и Рисунок 5 для кишечника. Дополнительная информация о составе среды и реагентах, используемых для культивирования различных моделей органов, включена в дополнительные таблицы (Дополнительная таблица 1 для кожи; Дополнительная таблица 2 для альвеол; Дополнительная таблица 3 для дыхательных путей и дополнительная таблица 4 для кишечника).
Чип с открытым верхом представляет собой платформу для исследования сложного клеточного взаимодействия, происходящего между эндотелием, стромой и эпителием в контролируемой микросреде в режиме реального времени. Эта технология предлагает критические преимущества по сравнению с обы…
The authors have nothing to disclose.
Никакой
10x EMEM | Lonza | 12-684F | Medium; Stroma |
18 Gauge needle | MicroGroup | 316H18RW | Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard |
19 Gauge needle | MicroGroup | 316H19RW | Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard |
2-Stop PharMed BPT | Cole-Palmer | EW-95723-12 | Tube, 0.25 mm, 12/pack |
70% ethanol and wipes | - | - | For surface sterilization |
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP) | Sigma | B7880 | Medium supplement |
A-83-01 | Tocris | 2939 | |
Adenine | Sigma | A9795 | |
Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634010 | |
Airway Epithelial Cells | Lifeline Cell Technology | FC-0016 | |
Aluminum foil | - | - | - |
Alveolar cells | Cell Biologics | H6621 | |
Anti-ABCA3 | ABCAM | ab24751 | Mouse monoclonal antibody [3C9] |
Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 | ABCAM | ab215225 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
Anti-Aquaporin5 | ABCAM | ab92320 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
Anti-beta IV Tubulin | ABCAM | ab11315 | Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] |
Anti-CD31 (PECAM-1) | ABCAM | ab9498 | Mouse monoclonal [JC/70A] antibody |
Anti-CK5 | ABCAM | ab75869 | Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] |
Anti-Cytokeratin 10 | ThermoFisher | MA5-13705 | Mouse monoclonal antibody (DE-K10) |
Anti-Cytokeratin 14 | ABCAM | ab7800 | Mouse monoclonal antibody |
Anti-E-Cadherin | ABCAM | ab1416 | Mouse monoclonal antibody |
Anti-Filaggrin | ThermoFisher | PA5-79267 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-HTI-56 | Terrace Biotech | TB-29AHT1-56 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
Anti-HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | Mouse monoclonal antibody (IgM) |
Anti-Involucrin | ThermoFisher | MA5-11803 | Mouse monoclonal antibody (SY5) |
Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ | Biolengend | 618902 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-Ki67 | ABCAM | ab8191 | Mouse monoclonal antibody [B126.1] |
Anti-LAMP3 | ABCAM | ab111090 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-Mature SP-B | Seven Hill | WRAB-48604 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-MUC5AC | ThermoFisher | PA5-34612 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-Mucin-2 | SantaCruz Biotechnology | sc-7314 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
Anti-p63 | Dako | GA662 | Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 |
Anti-PCNA | ThermoFisher | PA5-32541 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-Podoplanin (AT-1α) | ABCAM | ab128994 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B | ABCAM | ab40876 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-Surfactant C | Seven Hill | WRAB-9337 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-Uteroglobin/SCGB1A1 | Hycult Biotech | HM2178 | Mouse monoclonal antibody [AY1E6] |
Anti-VE-cadherin | ABCAM | ab33168 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-ZO-1 | ThermoFisher | 33-9100 | Mouse monoclonal antibody [1A12] |
Ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
Aspirating pipettes | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polystyrene, individually wrapped |
Aspirating tips | - | - | Sterile (autoclaved) |
B27 | Thermo | 17504044 | |
Blocker BSA (10X) in PBS solution | ThermoFisher | 37525 | Blocker agent |
Calcium Chloride | Sigma | C7902 | |
CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
Collagen I | Advanced Biomatrix | 5133 | 10 mg/mL (Stroma) |
Collagen I | Advanced BioMatrix | 5005 | 3 mg/mL (Vascular ECM) |
Collagen IV | Sigma | C5533 | |
Collagen-IV | Sigma | C5533-5MG | Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL |
Colonic Fibroblasts | Cell Biologics | H6231 | |
Colonic microvascular endothelial cells | Cell Biologics | H6203 | |
Conical tubes | - | - | 15 mL and 50 mL polypropylene, sterile |
Crosslinker (ER-1) | Emulate | 10461 | 5 mg powder |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | DNA probe |
Dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-010 | |
Dermal microvascular endothelial cells | ATCC | CRL-3243 | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
DMEM | ThermoFisher | 11054020 | |
DMEM/F-12 | GIBCO | 11320082 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | Basal medium for ALI medium |
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150105 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175472 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150107 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150073 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175470 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150075 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+) | Corning | 21-031-CV | 1x |
Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-60170 | Medium supplement |
F-12 Ham’s | Invitrogen | 21700-108 | For vascular ECM |
FibriCol | Advanced BioMatrix | 5133-20ML | Collagen-I solution (10 mg/mL) |
Fibronectin | Corning | 356008 | |
Fibronectin, Human, Natural, | Corning | 47743-654 | human plasma fibronectin |
Fine-tip precision tweezers | Aven | 18056USA | Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers |
Glutamax | Invitrogen | 21700-108 | |
Glutamax | Invitrogen | 35050061 | |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594) | ABCAM | ab150080 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150115 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC) | ABCAM | ab6785 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-21124 | Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody |
Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21042 | Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody |
Handheld vacuum aspirator | Corning | 4930 | - |
Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30066.03 | |
Hemocytometer | - | - | - |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149 | |
HEPES | Thermo | 15630080 | |
Human [Leu15] – Gastrin | Sigma | G9145 | |
Human colonoids | Obtained from clinical resections | Obtained from clinical resections | |
Human EGF Recombinant Protein | Thermo | PHG0311L | |
human epithelial growth factor | Thermo | PHG0311 | |
HyClone FetalClone II Serum (U.S.) | GE Healthcare | SH30066.02HI | Sterile FBS heat-inactivated |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma | H4881 | |
Hydrocortisone | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
Ice bucket | - | - | - |
Ismatec IPC-N | Cole-Palmer | EW-78000-41 | Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips) |
ITES | BioWhittaker | 17-839Z | |
Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK | PromoCell | C-63821 | |
Keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
Laminin | Biolamina | CT521-0501 | |
Laminin, 521 CTG (CT521) | Biolamina | CT521-0501 | human recombinant laminin 521 |
Lung Fibroblast | Cell Biologics | H6013 | |
Lung Fibroblast | Lifeline Cell Technology | FC-0049 | |
Lung microvascular endothelial cells | Lonza | CC-2527 | |
Lung smooth muscle cells | Lifeline Cell Technology | FC-0046 | |
Manual counter | - | - | - |
Masterflex (TPE) Transfer Tubing | Cole-Palmer | FV-96880-02 | PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD |
Medium 199, no phenol red | Thermo | 11043023 | |
Microcentrifuge tube | - | - | 1.5 mL, sterile |
Microscope (with camera) | - | - | For bright-field imaging |
N2 | Sigma | 17502001 | |
N-acetyl cysteine | Sigma | A5099 | |
Noggin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | N17001 | |
Normal Goat Serum | ThermoFisher | 50062Z | Blocking solution |
O-phosphosrylethanolamine | Sigma | P0503 | |
Paraformaldehyde (4% wt/vol) | EMS | 15710 | Fixing agent |
Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333 | 10,000 U/mL; 10 mg/mL |
Pipette tips | - | - | P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion |
Pipette | Gilson | F167380 | P20, P200, and P1000 |
PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement) | AMSBIO (or Thermo) | N/A (or C1910828010) | |
Poly-L-Lysine coated microscope glass slides | Sigma | P0425 | Glass slides |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Progesterone | Sigma | P8783 | |
ProLong Gold | ThermoFisher | P36931 | Antifade Mountant with DAPI |
Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
ROCK inhibitor (Y27632) | Tocris | TB1254-GMP/10 | |
R-spondin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | SCC111 | |
SAGM SingleQuots supplements | Lonza | CC-4124 | |
SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM | Lonza | CC-4124 | Medium supplements |
SB2001190 | Tocris | 1264/10 | |
Serological pipettes | - | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile |
Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM) | Lonza | CC-4124 | |
Solvent Buffer (ER-2) | Emulate | 10462 | 25 mL bottle |
Steriflip-HV | Millipore | SE1M003M00 | Sterile filtering conical tube |
Sterilin 100 mm Square Petri Dishes | Thermo | 103 | Sterile, 1 per 6 chips |
T25 flasks | - | - | - |
T75 flasks | - | - | - |
Tri-iodothyronine | Sigma | T5516 | |
Triton X-100 (0.3% (vol/vol) | Sigma | T8787 | Permeabilization agent |
Trypan blue | Sigma | 93595 | 0.4% solution |
TrypEE solution | Sigma | 12604013 | Cell detaching solution |
TWEEN-20 | Sigma | P2287 | Permeabilization agent |
UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2) | VWR | 21474-598 | UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L |
Vacuum set-up | - | - | Minimum pressure: -70 kPa |
Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-64420 | |
VEGF-165 | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
Von Willebrand Factor conjugated FITC | ABCAM | ab8822 | Sheep polyclonal antibody |
Water bath (or beads) | - | - | Set to 37 °C |
Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 |