Reconstitución de la citoarquitectura y la función de los tejidos epiteliales humanos en un chip de órgano abierto

Summary

El presente protocolo describe las capacidades y las modalidades esenciales de cultivo del Open-Top Organ-Chip para el establecimiento exitoso y la maduración de cultivos de órgano en chip de espesor completo de tejidos primarios (piel, alvéolo, vías respiratorias e intestino), brindando la oportunidad de investigar diferentes aspectos funcionales de la interfaz epitelial/mesenquimal y nicho vascular humana in vitro.

Abstract

Casi todos los órganos humanos están revestidos con tejidos epiteliales, que comprenden una o varias capas de células estrechamente conectadas organizadas en estructuras tridimensionales (3D). Una de las principales funciones del epitelio es la formación de barreras que protegen los tejidos subyacentes contra insultos físicos y químicos y agentes infecciosos. Además, los epitelios median el transporte de nutrientes, hormonas y otras moléculas de señalización, a menudo creando gradientes bioquímicos que guían el posicionamiento celular y la compartimentación dentro del órgano. Debido a su papel central en la determinación de la estructura y función de los órganos, los epitelios son objetivos terapéuticos importantes para muchas enfermedades humanas que no siempre son capturadas por modelos animales. Además de las obvias diferencias de especie a especie, la realización de estudios de investigación sobre la función de barrera y las propiedades de transporte de los epitelios en animales se ve agravada por la dificultad de acceder a estos tejidos en un sistema vivo. Si bien los cultivos de células humanas bidimensionales (2D) son útiles para responder preguntas científicas básicas, a menudo producen predicciones in vivo deficientes. Para superar estas limitaciones, en la última década, una gran cantidad de plataformas biomiméticas de microingeniería, conocidas como órganos en un chip, han surgido como una alternativa prometedora a las pruebas tradicionales in vitro y en animales. Aquí, describimos un Open-Top Organ-Chip (o Open-Top Chip), una plataforma diseñada para modelar tejidos epiteliales específicos de órganos, incluyendo piel, pulmones e intestinos. Este chip ofrece nuevas oportunidades para reconstituir la arquitectura multicelular y la función de los tejidos epiteliales, incluida la capacidad de recrear un componente estromal 3D mediante la incorporación de fibroblastos específicos de tejido y células endoteliales dentro de un sistema mecánicamente activo. Este chip abierto proporciona una herramienta sin precedentes para estudiar las interacciones epiteliales / mesenquimales y vasculares a múltiples escalas de resolución, desde células individuales hasta construcciones de tejido multicapa, lo que permite la disección molecular de la diafonía intercelular de los órganos epitelializados en la salud y la enfermedad.

Introduction

Históricamente, los científicos han confiado en las pruebas preclínicas en animales para el descubrimiento de fármacos, pero un número creciente de estos métodos han sido cuestionados debido a la mala correlación con el resultado humano¹. La implementación de los principios de las “3R” para reemplazar, reducir y refinar la experimentación animal insta a los científicos a encontrar nuevos métodos alternativos in vitro para apoyar la evaluación preclínica de riesgos de toxicología química y de medicamentos². Sin embargo, muchos modelos in vitro desarrollados hasta la fecha carecen de la arquitectura biológica, la complejidad celular y el entorno mecánico necesarios para recapitular la naturaleza dinámica de los órganos vivos humanos ^3,4.

Los sistemas preclínicos in vitro convencionales suelen emplear monocultivos 2D de células humanas cultivadas sobre una superficie plástica rígida. Estos métodos proporcionan una herramienta para realizar estudios mecanicistas simples y permiten una rápida selección de candidatos a fármacos. Debido a su costo relativamente bajo y alta robustez, los modelos 2D a menudo se combinan con sistemas automáticos de alto rendimiento y se utilizan para la identificación rápida de posibles candidatos a fármacos durante la etapa inicial del proceso de desarrollo de fármacos ^5,6. Sin embargo, tales modelos 2D no proporcionan un enfoque traslacional para modelar respuestas a nivel de tejido, órgano o sistémicas a candidatos terapéuticos, lo cual es necesario para predicciones precisas de la seguridad y eficacia de los medicamentos durante la etapa preclínica de su desarrollo. Los cultivos de células planas no recapitulan el microambiente tisular nativo, incluida la compleja interacción multicelular, las propiedades biomecánicas y la arquitectura tridimensional (3D) de los tejidos humanos⁷. Las células que crecen en una superficie plana a menudo no adquieren un fenotipo maduro y, por lo tanto, no pueden responder a los estímulos farmacológicos como lo harían en el tejido nativo. Por ejemplo, las células epiteliales alveolares humanas primarias cultivadas in vitro exhiben un fenotipo escamoso y pierden marcadores fenotípicos clave, incluidas las proteínas surfactantes C y B (SP-C y SP-B)⁸. Además de la diferenciación insuficiente, las células primarias con frecuencia se vuelven insensibles a los factores estresantes biológicos in vitro, ya que ciertas vías bioquímicas asociadas con la inflamación del tejido se vuelven no funcionales⁹. Tal pérdida de función celular parece estar asociada principalmente con el uso de sustratos rígidos, así como con la falta de factores solubles liberados naturalmente por las células estromales específicas del tejido, como los fibroblastos pulmonares y las células del músculo liso^10,11.

La comprensión de que la falta de complejidad quimiofísica y biológica limita el comportamiento fisiológico de las células in vitro ha fomentado el desarrollo de modelos multicelulares más sofisticados, que han demostrado captar mejor la complejidad de los tejidos humanos fuera del cuerpo^12,13. Desde la creación de los primeros modelos de cocultivo a principios de la década de 1970¹⁴, la introducción de hidrogeles sintéticos y naturales ha mejorado significativamente la capacidad de imitar microambientes de tejidos nativos y se ha convertido en una herramienta invaluable para impulsar la diferenciación celular, guiar la autoorganización de las células en estructuras similares a los tejidos y la restauración de las funciones de los tejidos nativos^15,16. Por ejemplo, cuando se cultivan en el andamio 3D apropiado, las células humanas pueden autoorganizarse en estructuras funcionales como esferoides u organoides, expresando marcadores de células madre, y son capaces de autorrenovarse¹⁷. En contraste, las células humanas (incluidas las células madre), cuando se cultivan en sustratos 2D tradicionales, envejecen rápidamente y sufren senescencia después de unos pocos pasajes¹⁸. Además, los hidrogeles pueden ser “adaptados” para que coincidan con propiedades específicas del tejido, como porosidad, tamaño de poro, grosor de fibra, viscoelasticidad, topografía y rigidez, o diseñados con componentes celulares derivados de tejidos y / o moléculas bioactivas que permiten la emulación de las condiciones fisiológicas o patológicas^19,20. A pesar de su enorme potencial para las pruebas farmacológicas, los modelos 3D basados en hidrogel utilizados en la investigación farmacéutica no recapitulan completamente la compleja citoarquitectura de los tejidos in vivo y carecen de importantes estímulos hemodinámicos y mecánicos normalmente presentes en el cuerpo humano, incluyendo la presión hidrostática, el estiramiento cíclico y el cizallamiento del fluido²¹.

Los sistemas microfisiológicos (MPS) como los Organs-on-chips (OOCs) han surgido recientemente como herramientas capaces de capturar respuestas fisiológicas complejas in vitro^22,23. Estos modelos a menudo emplean el uso de plataformas microfluídicas, que permiten el modelado del microambiente dinámico de los órganos vivos.

Hemos combinado los principios de la bioingeniería de tejidos 3D y la mecanobiología para crear un modelo de chip abierto de tejido epitelial humano complejo. Esto nos permitió recapitular de cerca el microambiente multicelular y dinámico de los tejidos epiteliales. Esto incluye señales bioquímicas y biomecánicas específicas del tejido naturalmente presentes en los órganos vivos, pero a menudo descuidadas por los modelos tradicionales in vitro ²⁴. El chip Open-Top incorpora dos compartimentos: un compartimento vascular (Figura 1A) y un compartimento estromal (Figura 1B) separados por una membrana porosa, lo que permite la difusión de nutrientes entre las dos cámaras (Figura 1C). El compartimiento vascular está expuesto a un flujo continuo de fluido para recapitular el esfuerzo cortante fisiológico, mientras que el diseño estirable de la cámara estromal permite el modelado de la tensión mecánica asociada con los movimientos respiratorios o la peristalsis intestinal. El compartimento estromal alberga el andamio de hidrogel 3D sintonizable diseñado para apoyar el crecimiento fisiológico de fibroblastos específicos de tejido. Posee una tapa extraíble que facilita el establecimiento de una interfaz aire-líquido, una condición que permite una mayor emulación de la fisiología humana de los tejidos de la mucosa, así como el acceso directo al tejido para administrar medicamentos directamente sobre la capa epitelial. La Figura Suplementaria 1 captura algunos de los componentes clave del diseño del chip Open-Top, incluidas las dimensiones y los compartimentos biológicos (Figura Suplementaria 1A-D), así como los principales pasos técnicos descritos en este protocolo (Figura Suplementaria 1E).

La perfusión del chip Open-Top se logra con una bomba peristáltica programable (Figura 1D). La configuración de la bomba peristáltica permite que 12 chips descapotables se perfundan simultáneamente. La mayoría de las incubadoras pueden albergar dos configuraciones que permiten el cultivo de hasta 24 chips por incubadora. El estiramiento mecánico se logra utilizando un regulador de presión de vacío programable hecho a medida (Figura 1E). Consiste en un regulador de vacío electroneumático controlado electrónicamente por un convertidor de digital a analógico. En otras palabras, el regulador de vacío electroneumático genera un perfil de vacío sinusoidal con una amplitud y frecuencia que es determinada por el usuario. La deformación cíclica que oscila entre el 0% y el 15% se genera aplicando presión negativa al canal de vacío del chip abierto a una amplitud que varía de 0 a -90 kPa y una frecuencia de 0,2 Hz. Es un sistema hecho a medida equivalente a la unidad de deformación Flexcell disponible comercialmente previamente adoptada y descrita en otros documentos²⁵. Para imitar la deformación mecánica del tejido asociada, por ejemplo, con el movimiento respiratorio del pulmón o el peristaltismo del intestino, el actuador neumático aplica ondas sinusoidales de vacío / deformación cuya magnitud y amplitud se pueden ajustar para que coincidan con el nivel fisiológico de tensión y frecuencia que experimentan las células humanas en su tejido nativo.

Aquí, describimos un método eficiente y reproducible para diseñar y cultivar equivalentes de epitelio organotípico en una plataforma prototipo de chip Open-Top. Permite la generación de modelos de órganos complejos como piel, alvéolos, vías respiratorias y colon al tiempo que integra un flujo de fluido vascular y estiramiento mecánico. Describiremos los aspectos técnicos clave que deben considerarse al implementar los principios de la ingeniería de tejidos para generar modelos epiteliales complejos. Discutiremos las ventajas y posibles limitaciones del diseño actual.

Una visión general de los principales pasos utilizados para lograr la maduración de tejidos y órganos, incluidos los parámetros de flujo y estiramiento, se informa en: Figura 2 para la piel, Figura 3 para el alvéolo, Figura 4 para las vías respiratorias y Figura 5 para el intestino. En las tablas suplementarias se incluye información adicional sobre la composición de los medios y los reactivos utilizados para el cultivo de los diferentes modelos de órganos (Tabla suplementaria 1 para la piel; Tabla complementaria 2 para el alvéolo; Tabla complementaria 3 para la vía aérea y Tabla complementaria 4 para el intestino).

Protocol

Los colonoides humanos se obtuvieron de resecciones intestinales de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Bioseguridad del Hospital de Niños de Cincinnati (IBC 2017-2011). 1. Activación de superficie Preparación del búfer de activaciónColoque el reticulante y los reactivos tampón del disolvente debajo del gabinete de bioseguridad (BSC) y déjelos equilibrarse a temperatura ambiente (RT) durante 10 minutos antes de su uso. R…

Representative Results

Micropatrones superficialesEl micropatrón de la matriz extracelular (ECM) se puede utilizar para replicar la configuración espacial de la interfaz de la cripta intestinal. La configuración del chip abierto se puede modificar para integrar sellos micropatronados diseñados específicamente para imitar la topografía natural de la interfaz epitelio-estroma colónico (Figura 6A, B) y las criptas intestinales a escala micrométrica (F…

Discussion

El chip Open-Top representa una plataforma habilitadora para investigar la compleja interacción celular que ocurre entre el endotelio, el estroma y el epitelio en un microambiente controlado, en tiempo real. Esta tecnología ofrece ventajas críticas sobre los cultivos organotípicos y organoides convencionales, como la integración de señales físicas y bioquímicas que son relevantes para reconstituir el microambiente del tejido humano, incluido el cizallamiento fluídico (flujo), el estiramiento cíclico y la recons…

Materials

10x EMEM	Lonza	12-684F	Medium; Stroma
18 Gauge needle	MicroGroup	316H18RW	Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard
19 Gauge needle	MicroGroup	316H19RW	Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard
2-Stop PharMed BPT	Cole-Palmer	EW-95723-12	Tube, 0.25 mm, 12/pack
70% ethanol and wipes	-	-	For surface sterilization
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP)	Sigma	B7880	Medium supplement
A-83-01	Tocris	2939
Adenine	Sigma	A9795
Advanced DMEM/F12	Thermo	12634010
Airway Epithelial Cells	Lifeline Cell Technology	FC-0016
Aluminum foil	-	-	-
Alveolar cells	Cell Biologics	H6621
Anti-ABCA3	ABCAM	ab24751	Mouse monoclonal antibody [3C9]
Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647	ABCAM	ab215225	Rabbit monoclonal antibody [EPR3747]
Anti-Aquaporin5	ABCAM	ab92320	Rabbit monoclonal antibody [EPR3747]
Anti-beta IV Tubulin	ABCAM	ab11315	Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6]
Anti-CD31 (PECAM-1)	ABCAM	ab9498	Mouse monoclonal [JC/70A] antibody
Anti-CK5	ABCAM	ab75869	Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6]
Anti-Cytokeratin 10	ThermoFisher	MA5-13705	Mouse monoclonal antibody (DE-K10)
Anti-Cytokeratin 14	ABCAM	ab7800	Mouse monoclonal antibody
Anti-E-Cadherin	ABCAM	ab1416	Mouse monoclonal antibody
Anti-Filaggrin	ThermoFisher	PA5-79267	Rabbit polyclonal antibody
Anti-HTI-56	Terrace Biotech	TB-29AHT1-56	Mouse monoclonal antibody (IgG1)
Anti-HTII-280	Terrace Biotech	TB-27AHT2-280	Mouse monoclonal antibody (IgM)
Anti-Involucrin	ThermoFisher	MA5-11803	Mouse monoclonal antibody (SY5)
Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ	Biolengend	618902	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Ki67	ABCAM	ab8191	Mouse monoclonal antibody [B126.1]
Anti-LAMP3	ABCAM	ab111090	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Mature SP-B	Seven Hill	WRAB-48604	Rabbit polyclonal antibody
Anti-MUC5AC	ThermoFisher	PA5-34612	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Mucin-2	SantaCruz Biotechnology	sc-7314	Mouse monoclonal antibody (IgG1)
Anti-p63	Dako	GA662	Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63
Anti-PCNA	ThermoFisher	PA5-32541	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Podoplanin (AT-1α)	ABCAM	ab128994	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B	ABCAM	ab40876	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Surfactant C	Seven Hill	WRAB-9337	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Uteroglobin/SCGB1A1	Hycult Biotech	HM2178	Mouse monoclonal antibody [AY1E6]
Anti-VE-cadherin	ABCAM	ab33168	Rabbit polyclonal antibody
Anti-ZO-1	ThermoFisher	33-9100	Mouse monoclonal antibody [1A12]
Ascorbic acid	Sigma	A4544
Aspirating pipettes	Corning / Falcon	357558	2 mL, polystyrene, individually wrapped
Aspirating tips	-	-	Sterile (autoclaved)
B27	Thermo	17504044
Blocker BSA (10X) in PBS solution	ThermoFisher	37525	Blocker agent
Calcium Chloride	Sigma	C7902
CHIR 99021	Tocris	4423
Collagen I	Advanced Biomatrix	5133	10 mg/mL (Stroma)
Collagen I	Advanced BioMatrix	5005	3 mg/mL (Vascular ECM)
Collagen IV	Sigma	C5533
Collagen-IV	Sigma	C5533-5MG	Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL
Colonic Fibroblasts	Cell Biologics	H6231
Colonic microvascular endothelial cells	Cell Biologics	H6203
Conical tubes	-	-	15 mL and 50 mL polypropylene, sterile
Crosslinker (ER-1)	Emulate	10461	5 mg powder
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	ThermoFisher	D3571	DNA probe
Dermal fibroblasts	ATCC	PCS-201-010
Dermal microvascular endothelial cells	ATCC	CRL-3243
Dexamethasone	Sigma	D4902
DMEM	ThermoFisher	11054020
DMEM/F-12	GIBCO	11320082
DMEM/F-12, GlutaMAX	GIBCO	10565-018	Basal medium for ALI medium
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	ABCAM	ab150105	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)	ABCAM	ab175472	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150107	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	ABCAM	ab150073	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)	ABCAM	ab175470	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150075	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+)	Corning	21-031-CV	1x
Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli	PromoCell	C-60170	Medium supplement
F-12 Ham’s	Invitrogen	21700-108	For vascular ECM
FibriCol	Advanced BioMatrix	5133-20ML	Collagen-I solution (10 mg/mL)
Fibronectin	Corning	356008
Fibronectin, Human, Natural,	Corning	47743-654	human plasma fibronectin
Fine-tip precision tweezers	Aven	18056USA	Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers
Glutamax	Invitrogen	21700-108
Glutamax	Invitrogen	35050061
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594)	ABCAM	ab150080	Goat Anti-Mouse secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150115	Goat Anti-Mouse secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC)	ABCAM	ab6785	Goat Anti-Mouse secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568	ThermoFisher	A-21124	Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-21042	Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody
Handheld vacuum aspirator	Corning	4930	-
Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS)	GE Healthcare Life Sciences	SH30066.03
Hemocytometer	-	-	-
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma	H3149
HEPES	Thermo	15630080
Human [Leu15] – Gastrin	Sigma	G9145
Human colonoids	Obtained from clinical resections		Obtained from clinical resections
Human EGF Recombinant Protein	Thermo	PHG0311L
human epithelial growth factor	Thermo	PHG0311
HyClone FetalClone II Serum (U.S.)	GE Healthcare	SH30066.02HI	Sterile FBS heat-inactivated
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt	Sigma	H4881
Hydrocortisone	PromoCell	C-64420	Medium supplement
Ice bucket	-	-	-
Ismatec IPC-N	Cole-Palmer	EW-78000-41	Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips)
ITES	BioWhittaker	17-839Z
Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK	PromoCell	C-63821
Keratinocytes	ATCC	PCS-200-010
Laminin	Biolamina	CT521-0501
Laminin, 521 CTG (CT521)	Biolamina	CT521-0501	human recombinant laminin 521
Lung Fibroblast	Cell Biologics	H6013
Lung Fibroblast	Lifeline Cell Technology	FC-0049
Lung microvascular endothelial cells	Lonza	CC-2527
Lung smooth muscle cells	Lifeline Cell Technology	FC-0046
Manual counter	-	-	-
Masterflex (TPE) Transfer Tubing	Cole-Palmer	FV-96880-02	PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD
Medium 199, no phenol red	Thermo	11043023
Microcentrifuge tube	-	-	1.5 mL, sterile
Microscope (with camera)	-	-	For bright-field imaging
N2	Sigma	17502001
N-acetyl cysteine	Sigma	A5099
Noggin (HEK293T conditioned medium)	Sigma	N17001
Normal Goat Serum	ThermoFisher	50062Z	Blocking solution
O-phosphosrylethanolamine	Sigma	P0503
Paraformaldehyde (4% wt/vol)	EMS	15710	Fixing agent
Penicillin Streptomycin	GIBCO	15140122
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4333	10,000 U/mL; 10 mg/mL
Pipette tips	-	-	P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion
Pipette	Gilson	F167380	P20, P200, and P1000
PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement)	AMSBIO (or Thermo)	N/A (or C1910828010)
Poly-L-Lysine coated microscope glass slides	Sigma	P0425	Glass slides
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1
Progesterone	Sigma	P8783
ProLong Gold	ThermoFisher	P36931	Antifade Mountant with DAPI
Retinoic Acid	Sigma	R2625
ROCK inhibitor (Y27632)	Tocris	TB1254-GMP/10
R-spondin (HEK293T conditioned medium)	Sigma	SCC111
SAGM SingleQuots supplements	Lonza	CC-4124
SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM	Lonza	CC-4124	Medium supplements
SB2001190	Tocris	1264/10
Serological pipettes	-	-	2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile
Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM)	Lonza	CC-4124
Solvent Buffer (ER-2)	Emulate	10462	25 mL bottle
Steriflip-HV	Millipore	SE1M003M00	Sterile filtering conical tube
Sterilin 100 mm Square Petri Dishes	Thermo	103	Sterile, 1 per 6 chips
T25 flasks	-	-	-
T75 flasks	-	-	-
Tri-iodothyronine	Sigma	T5516
Triton X-100 (0.3% (vol/vol)	Sigma	T8787	Permeabilization agent
Trypan blue	Sigma	93595	0.4% solution
TrypEE solution	Sigma	12604013	Cell detaching solution
TWEEN-20	Sigma	P2287	Permeabilization agent
UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2)	VWR	21474-598	UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L
Vacuum set-up	-	-	Minimum pressure: -70 kPa
Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli	PromoCell	C-64420
VEGF-165	PromoCell	C-64420	Medium supplement
Von Willebrand Factor conjugated FITC	ABCAM	ab8822	Sheep polyclonal antibody
Water bath (or beads)	-	-	Set to 37 °C
Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium)	ATCC	CRL-2647