在这里,我们提出了一种协议来评估抗生素洗脱聚合物的抗菌功效,以通过使用市售的基于ATP的实时发光微生物活力测定来模拟预防性临床应用。该方法能够监测药物洗脱材料的纵向活性,并且可以广泛地适用于测试抗菌药物输送平台。
超高分子量聚乙烯(UHMWPE)作为承重表面广泛用于全关节置换术。假体周围关节感染,其中大部分发生在关节置换后不久,占整个膝关节翻修手术的近25%,完全根除细菌感染是一个重大挑战。解决这个问题的一个有希望的方法是确保局部持续输送足以抑制细菌的抗生素浓度,以支持常规的全身性抗生素预防。对开发有效的当地药物输送装置的研究越来越多。尽管已建立的药物抗菌测试方法可用于测试药物洗脱材料的抗菌功效,但它们缺乏提供实时和纵向抗菌功效数据,这些数据可以与抗生素从这些设备中洗脱曲线相关联。在这里,我们报告了一种直接和通用的方法来确定抗生素洗脱UHMWPE植入物的抗菌功效。该方法可用作在漫长实验的每个时间点避免细菌培养的平台,也可以适用于其他局部给药装置。
骨关节炎是一种严重的退行性疾病,困扰着全世界5亿成年人1。治疗终末期关节炎的金标准是全关节置换术,预计到 2030 年,仅在美国每年就有超过 200 万患者进行全关节置换术2,全球需求也将大幅增加3,4。该过程涉及用金属/陶瓷和高交联超高分子量聚乙烯(UHMWPE)制成的承重合成材料替换关节的关节软骨表面。全关节置换术显着改善了患有关节炎的患者的生活质量5,但危及植入物性能和患者满意度的重大并发症是假体周围关节感染(PJI),占翻修手术的15%-25%6。在大多数情况下,感染的原因被认为是手术期间植入部位的微生物污染7。然后,污染群体在植入物和组织表面扩大8。宿主免疫系统作为响应被触发,但污染生物的生长速度和生物膜形成可以使它们逃避免疫细胞,这可能导致细胞因子和趋化因子风暴增加,而不会根除细菌9,10,11。由此产生的骨骼深度感染危及植入物的固定和性能以及患者的健康12。
金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌是PJI13的主要致病微生物。葡萄球菌感染的严重程度很高,因为它们对抗生素的耐药性增加,生物膜形成以及作为小菌落变异体持续存在的能力14,15,16。植入物相关感染是由于微生物粘附在植入物表面上以及建立复杂的生物膜基质,使细菌能够逃避有害的宿主免疫因子和有效浓度的抗生素14,15,16而发生的。常规治疗方法包括长时间静脉注射和口服抗生素组合17。这种方法的一个主要缺点是药物在感染部位的生物利用度低,并且难以达到足够浓度的抗生素以在治疗期间始终如一地根除细菌,这通常会导致不良结果18。为了解决这些缺点,设计了一种功能齐全的局部药物洗脱UHMWPE植入物,以确保有效浓度的抗生素持续释放到关节间隙19。药物洗脱植入物的局部洗脱用作补充工具,以防止植入物移除和组织清创后残留的任何细菌的生长和定植。这种抗生素洗脱UHMWPE的体外抗菌测试可以通过将材料直接与细菌孵育并通过铺板方法20,21定量细菌来进行。或者,可以使用琼脂盘扩散法、肉汤稀释法和定时杀灭测试等方法对淋洗液培养基的等分试样进行细菌测试22。所有这些方法都依赖于通过菌落计数和浊度测量收集等分试样后约16-18小时的生长观察。使用这些体外方法可以纵向定量抗生素从这些装置中洗脱;然而,为了确定这些浓度曲线的转化值,需要一种强大的实时体外方法来评估抗菌活性。
本研究中使用的微生物活力测定是通过使用基于荧光素-荧光素酶的检测技术测量活细菌细胞释放的对应于三磷酸腺苷(ATP)的发光来定量活细菌的。ATP作为活细胞的能量货币,是生理上可行的细胞的直接指标。该试剂进行细胞裂解,从活细胞中释放ATP分子,然后以发光的形式进行检测。这种发光与样品中活细菌细胞的比例直接相关23。这是一种实时、简单、多功能、快速、基于单一试剂的检测方法,可适应革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的各种检测设计和条件。在这里,我们报告了一种使用基于微生物活力测定(例如BacTiter Glo)的改良时间杀灭测定法来确定与实验室和临床金 黄色葡萄 球菌菌株一起孵育的抗生素洗脱UHMWPE的实时抗菌活性的方法。虽然该方法是用特定的植入材料和特定的骨科应用来描述的,但该方法可以为测试具有临床应用的其他抗生素洗脱递送装置提供一个平台。
局部持续输送抗生素是治疗假体周围关节感染的必要工具。全身性抗生素是根除细菌感染的主要策略,局部洗脱被用作补充工具,以防止植入物移除和清创组织后残留的任何细菌的生长和定植。局部给药抗生素的曲线下有效面积(一段时间内的浓度)的目标尚不清楚。抗生素从这些装置中的洗脱可以在 体外纵向定量;然而,为了确定这些浓度曲线的翻译值,需要一种稳健的 体外 方法来评估抗菌活性。在本文中,描述了一种这样的实时方法来确定药物洗脱UHMWPE的抗菌活性,以用作关节置换的持续递送装置。
细菌活力的实时监测是一个令人感兴趣的关键参数,传统的微生物学方法缺乏适应研究这一特定方面的框架。本研究中使用的微生物活力测定是通过测量对应于三磷酸腺苷(ATP)的发光来定量活细菌的。为了直接研究从植入材料中洗脱的抗生素的时间依赖性活性,将三种具有不同抗生素敏感性特征的不同菌株与它们一起孵育。使用对庆大霉素和万古霉素具有不同耐药性的实验室和临床菌株的基本原理是了解给定植入物配方的活性范围。此外,针对这些不同人群的抗菌活性和功效取决于给药时间。该方法侧重于基于>70%的假体周围关节感染是由手术时伤口污染引起的预防这些菌株的可行性24。
作为开发该方法的起始接种物,使用1 x 105 CFU/mL。动物模型使用了不同的污染浓度,尽管对PJI的临床相关感染负荷知之甚少。PJI的动物感染模型已常规使用1 x 105 CFU建立,并且在标准化方法(CLSI)中广泛使用类似的范围来确定抗菌活性25,26,27。使用 1 x 105 CFU/mL 作为初始污染浓度,我们可以同时评估生长和根除参数。
传统上,MIC值是根据特定数量的细菌的恒定抗生素浓度确定的,并且它们无法证明抗菌作用的速率。由于这一方面,MIC值不提供定量区分来描述抗微生物活性谱28。当前方法的数据强调了评估抗生素的菌株依赖性杀伤动力学的优势,而不是使用MIC做出剂量决策。使用这种方法,可以区分植入材料影响不同菌株的程度和速率。从植入材料条中洗脱的庆大霉素在1天内有效根除L1163,在2-3天内根除ATCC 12600,但在根除L1101方面无效(图4)。除了庆大霉素洗脱对L1101(MIC >32μg/mL)由于其固有的庆大霉素耐药性(图4C)而预期缺乏活性外,当暴露于万古霉素时观察到亚群的持久性,其中L1101表现出中间耐药性。相比之下,L1163在万古霉素洗脱UHMWPE存在下被最终根除,尽管对万古霉素表现出与L1101相似的中间耐药性(两种菌株的MIC均为8μg/ mL)。
观察结果表明,庆大霉素对12600和L1163的活性率不同,庆大霉素敏感且MIC值相似(两种菌株的MIC为1μg/mL),以及万古霉素对中耐药L1101和L1163的活性程度不同(图4A,B),支持了这种在洗脱材料存在下的实时方法可以区分活性的纵向差异的假设。
除了解释给定洗脱浓度对这些细菌的有效性的结果的翻译价值外,还有几个实验方法学优势。(1)细菌浓度在给定时间瞬间测定,这与将细菌在肉汤或琼脂中孵育18-24小时以确定活力的传统方法相反。这段生长期可以为细菌从抗生素应激中恢复提供额外的时间,从而引入额外的可能的错误/变异性来源。(2)在保留细菌的同时不断更换培养基,与静态条件相比,细菌更类似于 体内 条件。(3)该测定固有地包括植入物的药物释放动力学,从而可以更好地预测性能。(4)该方法是使用常用的耗材开发的,不需要任何特定或昂贵的机器。
在进行体内动物研究和临床试验之前,需要强大的体外测试方法来评估药物递送应用。该测定可以修改和调整以适应各种方法和药物递送平台,例如颗粒、凝胶、薄膜和其他药物洗脱材料,以确定在模拟体外设置中根除细菌的效率。可以通过更改为合适的体外培养基环境来对样品设置进行修改,这已被证明会影响几种抗生素的活性29,30。
该方法还有助于确定活的贴壁细菌,这是有希望的,因为确定最低生物膜根除浓度的传统方法非常耗时并且提供不一致的结果。然而,该方法将在生物膜上进行严格测试,以开发一种可靠且稳健的方法来确定其灵敏度。基于ATP的发光方法可能足够灵敏,可以检测生物膜中包括持久性在内的活细菌形式,这些细菌可能会也可能不会在琼脂平板上作为可见菌落检测到。综上所述,这个多功能平台有可能结合相关参数来记录对目标药物的抗菌和抗生物膜活性的实时观察。
该方法的有效性取决于以下几个方面:
预先确定的洗脱特性和样品量
抗生素洗脱材料的洗脱曲线可以在该抗菌活性测量之前的单独实验中确定,以便可以确定在规定时间内积极进行实验所需的材料量。
容器和体积测定
重要的是设计一种设置,其中实验的培养基体积可以容纳相同材料的整个表面积,并确保有足够的体积使药物从载药表面畅通无阻地释放出来。所使用的设置基于先前的实验,确保这些亲水性药物的“完美下沉”条件,使其扩散不受溶解度限制的阻碍。
生长培养基特征
应研究生长培养基的选择,以确保所选药物的稳定性和最佳性能29。阳离子调节的Mueller Hinton肉汤(CAMHB)广泛用于肉汤稀释法,用于测定已知抗生素的MIC。该培养基可实现最佳的药物活性,而不会受到有毒次级代谢物积累的干扰31。该测定试剂已经过测试,并报告在不同类型的培养基中稳定,包括含有血清成分23,28的培养基。尽管相对发光单位值可能因不同介质而异,但已证明培养基的组分不会干扰测定32,33。实验体积进一步优化至1.5 mL,其接近成人膝关节间隙34中存在的滑液体积。
测定的温度稳定性
在测定中处理和添加发光试剂应在实验中以一致的方式进行。温度变化会改变测定的灵敏度,因此在将其添加到细菌中之前,重要的是在室温下孵育试剂2小时23。
试剂孵育时间
试剂的发光会随着时间的推移而衰减。发光信号的半衰期超过30分钟,这在很大程度上取决于实验中使用的培养基和细菌类型23。此外,孵育时间的任何差异(即,将试剂添加到细菌中和读取发光之间的时间)都将导致相同浓度细菌的读数不一致。根据制造商的说明在孵育5分钟后1分钟内拍摄时,观察到发光信号差异为5%(补充图 2)。考虑到这些数据,在整个研究过程中1分钟内记录发光读数,以确保信号损失不超过5%。此外,重要的是限制每个板的样品数量,以减少由于从第一个孔到最后一个孔的发光衰减而引入的误差。
在整个研究过程中维持细菌种群
该方法试图通过在每个时间点使用10,000 x g 高速离心10 min35将用过的培养基与细菌群体连续分离来模拟药物清除率和滑膜体积周转。这一关键步骤可确保所有活的和无活的细菌细胞沉降。此外,沉淀的细菌在新鲜的MHB中均匀复溶并转移到注射器设置中,从而促进受影响的微生物种群完全携带回实验设置。该方法的可重复性和可靠性在很大程度上依赖于模拟抗生素对初始接种物产生的微生物种群的持续暴露。
该方法的一个关键局限性是它是一种半静态测定,不能准确模拟药物半衰期和连续滑膜周转。然而,持续的培养基更换部分弥补了这一限制。微生物活力测定的灵敏度取决于菌株,范围为1 x 102-1 x 104 CFU/mL,这限制了检测能力。此外,需要为每个生物体绘制标准曲线,因为菌株类型有助于发光试剂的灵敏度和性能。细菌生长动力学和所用药物化合物的活性都可能受到培养基成分的影响,应进一步研究。
The authors have nothing to disclose.
这项工作部分由美国国立卫生研究院拨款编号AR077023(R01)和哈里斯骨科实验室资助。作者感谢罗德岛大学的Kerry Laplante博士和她的团队提供临床菌株L1101和L1163。
96 well plates – polystyrene, High Bind, white flat bottom wells, non-sterile, white, 100/cs | Corning, NY, USA | CLS3922-100EA | |
2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich, Germany | ||
ATCC 12600 | American Type culture Collection, VA, USA | ||
BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay | Promega Corporation, USA | G8231 | |
BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium) | Becton-Dickinson, USA | BD 211825 | purchased from Fisher Scientific, USA |
BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 3 mL | BD, USA | 309657 | |
BD Needle 5/8 in. single use, sterile, 25 G | BD, USA | 305122 | |
BD BBL Dehydrated Culture Media: Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton-Dickinson, USA | B12322 | purchased from Fisher Scientific, USA |
BD Difco Dehydrated Culture Media: Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar) | Becton-Dickinson, USA | DF0369-17-6 | purchased from Fisher Scientific, USA |
Boric Acid | Fisher Chemical, NJ, USA | ||
Branson 1800 ultrasonic bath | Emerson, MO, USA | ||
Corning Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid | Fisher Scientific, USA | 08-757-100D | |
Gentamicin Sulfate | Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, China | ||
Greiner UV-Star 96 well plates | Sigma Aldrich, Germany | M3812-40EA | |
Hydraulic press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
L1101 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
L1163 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
LSE benchtop shaking incubator | Corning, NY, USA | ||
Methanol, Optima for HPLC, Fisher Chemical | Fisher Scientific, NJ, USA | A454-1 | |
Napco CO2 6000 | Thermo Scientific, MA, USA | ||
PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4, Fisher BioReagents | Fisher Scientific, USA | BP24384 | |
Phthaldiadehyde ≥97% (HPLC) | Sigma Aldrich, Germany | P1378-5g | |
Plate reader (Synergy H1 | Biotek, VT, USA | ||
press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
shaker Innova 2100 | New Brunswick Scientific, NJ, USA | ||
ShopBot D2418 | ShopBot Tools, Inc., NC, USA | ||
Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich, Germany | ||
Thermo Scientific Reagent Grade Deionized Water | Fisher Scientific, USA | 23-751628 | |
UHMWPE | GUR1020, Celanese, TX, USA | ||
Vancomycin Hydrochloride | Fagron, The Netherlands | 804148 | |
WAB Turbula | WAB Turbula, Switzerland |