JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Механо-узловое измерение пор: быстрая платформа без меток для многопараметрических одноэлементных вязкоупругих измерений

Published: December 02, 2022
doi:
10.3791/64665
, , , , ,
1Graduate Program in Bioengineering,University of California, Berkeley and University of California, San Francisco, 2Department of Mechanical Engineering,University of California, Berkeley, 3Department of Electrical Engineering and Computer Sciences,University of California, Berkeley

Summary

Здесь представлен метод механического фенотипирования одиночных клеток с использованием микрофлюидной платформы на основе электроники, называемой механо-узлово-поровым зондированием (mechano-NPS). Эта платформа поддерживает умеренную пропускную способность 1-10 клеток / с при измерении как упругих, так и вязких биофизических свойств клеток.

Abstract

Клеточные механические свойства участвуют в самых разнообразных биологических процессах и заболеваниях, начиная от дифференцировки стволовых клеток и заканчивая метастазированием рака. Традиционные методы измерения этих свойств, такие как атомно-силовая микроскопия (AFM) и аспирация микропипетки (MA), захватывают богатую информацию, отражающую полную вязкоупругую реакцию клетки; однако эти методы ограничены очень низкой пропускной способностью. Высокопроизводительные подходы, такие как цитометрия деформируемости в реальном времени (RT-DC), могут измерять только ограниченную механическую информацию, поскольку они часто ограничиваются однопараметрическими показаниями, которые отражают только упругие свойства клетки. В отличие от этих методов, механо-узлово-поровое зондирование (mechano-NPS) представляет собой гибкую, не содержащую меток микрофлюидную платформу, которая устраняет разрыв в достижении многопараметрических вязкоупругих измерений ячейки с умеренной пропускной способностью. Измерение постоянного тока (DC) используется для мониторинга клеток, когда они проходят через микрофлюидный канал, отслеживая их размер и скорость до, во время и после того, как они проталкиваются через узкое сужение. Эта информация (т.е. размер и скорость) используется для количественной оценки поперечной деформации каждой ячейки, сопротивления деформации и восстановления после деформации. В общем, эта микрофлюидная платформа на основе электроники обеспечивает множественные вязкоупругие свойства ячейки и, следовательно, более полную картину механического состояния клетки. Поскольку он требует минимальной подготовки образцов, использует простое электронное измерение (в отличие от высокоскоростной камеры) и использует преимущества стандартного изготовления мягкой литографии, реализация этой платформы проста, доступна и адаптируется к последующему анализу. Гибкость, полезность и чувствительность этой платформы предоставили уникальную механическую информацию о разнообразном спектре клеток, с потенциалом для многих других применений в фундаментальной науке и клинической диагностике.

Introduction

Одиночные ячейки являются динамическими, вязкоупругими материалами1. Множество внутренних и внешних процессов (например, начало митоза или ремоделирования внеклеточного матрикса [ECM]) влияют на их структуру и состав 2,3,4, часто приводя к различным биофизическим свойствам, которые дополняют их текущее состояние. В частности, было показано, что механические свойства являются важными биомаркерами клеточного развития, физиологии и патологии, давая ценную количественную информацию, которая может дополнять канонические молекулярно-генетические подходы 5,6,7. Например, Li et al. недавно описали механические различия между лекарственно-устойчивыми и лекарственно-чувствительными клетками острого промиелоцитарного лейкоза, а также использовали РНК-seq для выявления дифференциально экспрессированных генов, связанных с цитоскелетом 8. Понимая сложное взаимодействие между механикой одной клетки и клеточной функцией, механофенотипирование имеет более широкое применение в преобразовании фундаментальной науки и клинической диагностики9.

Наиболее широко распространенным инструментом для измерения одноэлементной механики является атомно-силовая микроскопия (AFM). В то время как AFM позволяет локализованное измерение механических свойств ячеек с высоким разрешением, оно по-прежнему ограничено пропускной способностью <0,01 ячейки / с10. Альтернативно, оптические носилки, которые используют два расходящихся лазерных луча для улавливания и деформации взвешенных одиночных ячеек11, ограничены незначительно более высокой пропускной способностью <1 ячейки/с12. Последние достижения в области микрофлюидных технологий позволили создать новое поколение устройств для быстрой, одноклеточной, механической оценки12,13. Эти методы используют узкие сужающие каналы14,15, сдвиговой поток16 или гидродинамическое растяжение17 для быстрой деформации клеток при пропускной способности 10-1000 клеток / с18. Хотя скорость измерения этих подходов значительно выше, чем у обычных методов, они часто обменивают возможности высокой пропускной способности на ограниченные механические показания (дополнительная таблица 1). Все вышеупомянутые быстрые микрофлюидные методы сосредоточены на базовых однопараметрических метриках, таких как время прохождения или коэффициенты деформируемости, которые отражают только упругие свойства клетки. Однако, учитывая внутреннюю вязкоупругую природу отдельных клеток, надежная и тщательная механическая характеристика клеток требует рассмотрения не только упругих компонентов, но и вязких реакций.

Механо-узлово-поровое зондирование (mechano-NPS)2,8 (рисунок 1A) представляет собой микрофлюидную платформу, которая устраняет существующие ограничения с помощью одноклеточного механофенотипирования. Этот метод позволяет измерять несколько биофизических параметров одновременно, включая диаметр ячейки, относительную деформируемость и время восстановления после деформации, с умеренной пропускной способностью 1-10 клеток / с. Этот метод основан на узлово-поровом зондировании (NPS)19,20,21,22,23,24, которое включает в себя использование измерения четырехточечного зонда для измерения модулированного импульса тока, производимого клеткой, проходящей через микрофлюидный канал, который был сегментирован более широкими областями, называемыми «узлами». Модулированный импульс тока является результатом того, что ячейка частично блокирует поток тока в сегментах (т.е. «порах») и узлах, причем в первом блокируется больше тока, чем во втором. В механо-NPS один сегмент, «канал сжатия», уже, чем диаметр ячейки; следовательно, ячейка должна деформироваться, чтобы пройти весь канал (рисунок 1B). Диаметр ячейки может быть определен по величине субимпульса, образующегося при прохождении клеткой узлов-пор до канала сжатия (рис. 1B,C). Здесь |ΔInp|, падение тока, когда ячейка находится в поре, пропорционально объемному отношению ячейки к поре, Vячейка/Vпора 2,8,19. Жесткость клеток может быть определена по ΔTc, длительности значительно большего субимпульса, образующегося при прохождении клеткой канала сжатия (рис. 1B, C). Более жесткой ячейке потребуется больше времени для прохождения канала, чем более мягкой 2,8. Наконец, «восстановление» клетки, способность клетки возвращаться к своему первоначальному размеру и форме после деформации, может быть определено серией субпусков, образующихся при прохождении клеткой узлов-пор после канала сжатия (рис. 1B, C). Время восстановления, ΔTr, – это время, необходимое для того, чтобы текущие субпульсы вернулись к величине предыдущих субвыпусков, прежде чем клетка будет сжата. В целом, модулированные импульсы тока, полученные при прохождении клетки по микрофлюидному каналу, регистрируются и анализируются для извлечения соответствующих одноэлементных механических параметров (рисунок 1D)2,8.

Воспроизводимость и простота использования этой микрофлюидной платформы на основе электроники были ранее продемонстрированы25. Кроме того, платформа представляет собой низкий барьер для входа для одноклеточного механофенотипирования. Стандартная мягкая литография используется для изготовления микрофлюидных устройств. Измерительное оборудование состоит из недорогих компонентов, включая простую печатную плату (PCB), блок питания, предусилитель, плату сбора данных (DAQ) и компьютер. Наконец, для сбора и анализа данных доступен удобный код, обеспечивающий простую реализацию. Этот метод механофенотипирования может различать популяции незлокачественных и злокачественных эпителиальных клеточных линий молочной железы и легких, различать подлинии в первичных эпителиальных клетках молочной железы человека и характеризовать эффекты цитоскелетных возмущений и других фармакологических агентов 2,8. В целом, эта платформа является эффективным подходом для механофенотипирования одиночных клеток.

Protocol

1. Проектирование геометрии устройства Выберите ширину сегментов калибровки и восстановления, чтобы она была шире, чем диаметр самых больших измеряемых ячеек, но также поддерживала достаточное соотношение сигнал/шум (SNR). В дополнительной таблице 2 приведены при?…

Representative Results

Представленная здесь платформа механофенотипирования представляет собой простой и универсальный подход к измерению биофизических свойств отдельных клеток с умеренной пропускной способностью. Клетки протекают через микрофлюидный канал (рисунок 1А) с использованием ?…

Discussion

Измерение механических свойств отдельных ячеек с помощью этого метода механофенотипирования состоит из трех этапов: изготовление устройства, сбор данных и анализ данных. На каждом этапе есть заметные аспекты, которые могут значительно повлиять на результаты экспериментов. Во время и?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано грантами NIBIB 1R01EB024989-01 и NCI 1R01CA190843-01. A. L. и R. R. были поддержаны стипендией H2H8 Association Graduate Research Fellowship. K. L. C. была поддержана стипендией Национального научного фонда для аспирантов и стипендией Siebel Scholar Fellowship.

Materials

Acetone J.T. Baker 5356-05 Purity (GC)  ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker)
Aluminum Foil n/a n/a
Analog Low-Pass Filter ThorLabs EF504 ≤240 kHz Passband, Coaxial BNC Feedthrough (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0)
Biopsy Punch Integra Miltex 33-31AA-P/25 1mm, Disposable, with Plunger (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25)
Blade n/a n/a
BNC Cable Pomona Electronics 2249-C-12 https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_
medium=cpc&utm_campaign=
Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW&utm_term=
&utm_content=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ
pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx
mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs
w-EALw_wcB
Cleanroom Polyester Swab Thermo Fisher Scientific 18383 https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383
Current Preamplifier DL Instruments 1211 https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_
id=1419
Custom PCB (w/ components) n/a n/a see Supplemental files 4 and 5
DAQ Terminal Block National Instruments BNC-2120 https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html
DAQ to BNC-2110 cable  National Instruments SHC68-68-EPM https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html
Data Acquisition Board (DAQ) National Instruments PCI-6251 https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html
Dessicator Thermo Fisher Scientific 5311-0250 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250
Female BNC To Banana Plug Adapter Pomona Electronics 72909 https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 89510-186 https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs
Glass Cutter Chemglass CG-1179-21 https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips
Gold Etchant TFA Transene NC0977944 https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944
Hot Plate Thermo Fisher Scientific SP131825 
Isopropyl Alcohol Spectrum Chemical I1056-4LTPL Purity (GC)  ≥99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056)
Metal Hardware Enclosure Hammond Manufacturing EJ12126 https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Purity (GC)  ≥99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561)
MF-321 Developer Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/mf-321/
MICROPOSIT S1813 Positive Photoresist DuPont n/a https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049
Photomask Fineline Imaging n/a Photomask are custom ordered from our CAD designs (https://www.fineline-imaging.com/)
Plain Glass Microscope Slide Fisher Scientific 12-553-5B Material: Soda Lime, L75 x W50 mm, Thickness: 0.90–1.10 mm 
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001 https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/
Plastic Petri Dish Thermo Fisher Scientific FB0875712 100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712)
Pressure Controller Fluigent MFCS-EZ https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/
Pressure Controller Software Fluigent MAESFLO
Programming & Computation Software MATLAB R2021b for data acquisition and analysis (https://www.mathworks.com/products/matlab.html)
PTFE Tubing Cole Parmer 06417-31 0.032" ID x 0.056" (https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731)
Scepter 2.0 Handheld Automatic Cell Counter Millapore Sigma PHCC20060 https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060
Silicon Wafer Wafer World 2885 76.2 mm, Single Side Polished (https://www.waferworld.com/product/2885)
Spin Coater n/a n/a
SU-8 3025 Negative Photoresist Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/su-8-2000/
SU8 Developer Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/su-8-developer/
Sygard 184 Polydimethlysiloxane Dow Chemical 4019862 https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Tape Scotch 810-341296 https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid=
Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO
2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm
vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH
VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB
Titanium, Platinum, Gold n/a n/a
Triple Output Power Supply Keysight E36311A https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653
UV Mask Aligner Karl Suss America MJB3 Mask Aligner 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pegoraro, A. F., Janmey, P., Weitz, D. A. Mechanical properties of the cytoskeleton and cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (11), 022038 (2017).
  2. Kim, J., et al. Characterizing cellular mechanical phenotypes with mechano-node-pore sensing. Microsystems & Nanoengineering. 4, 17091 (2018).
  3. Mierke, C. T. Bidirectional mechanical response between cells and their microenvironment. Frontiers in Physics. 9, 619 (2021).
  4. Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, and metastasis: The force journey of a tumor cell. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1), 113-127 (2009).
  5. Nia, H. T., Munn, L. L., Jain, R. K. Physical traits of cancer. Science. 370 (6516), (2020).
  6. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
  7. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: The role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  8. Li, B., et al. Mechanical phenotyping reveals unique biomechanical responses in retinoic acid-resistant acute promyelocytic leukemia. iScience. 25 (2), 103772 (2022).
  9. Kozminsky, M., Sohn, L. L. The promise of single-cell mechanophenotyping for clinical applications. Biomicrofluidics. 14 (3), 031301 (2020).
  10. Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic force microscopy in characterizing cell mechanics for biomedical applications: A review. IEEE Transactions on Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
  11. Wottawah, F., et al. Optical rheology of biological cells. Physical Review Letters. 94 (9), 1-4 (2005).
  12. Darling, E. M., Di Carlo, D. High-throughput assessment of cellular mechanical properties. Annual Review of Biomedical Engineering. 17 (1), 35-62 (2015).
  13. Carey, T. R., Cotner, K. L., Li, B., Sohn, L. L. Developments in label-free microfluidic methods for single-cell analysis and sorting. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 11 (1), 1529 (2019).
  14. Bagnall, J. S., et al. Deformability of tumor cells versus blood cells. Scientific Reports. 5, 18542 (2015).
  15. Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
  16. Otto, O., et al. Real-time deformability cytometry: On-the-fly cell mechanical phenotyping. Nature Methods. 12 (3), 199-202 (2015).
  17. Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (20), 7630-7635 (2012).
  18. Guck, J., Chilvers, E. R. Mechanics meets medicine. Science Translational Medicine. 5 (212), 3-6 (2013).
  19. Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing: A robust, high-dynamic range method for detecting biological species. Lab on a Chip. 13 (7), 1302-1307 (2013).
  20. Carbonaro, A., Sohn, L. L. A resistive-pulse sensor chip for multianalyte immunoassays. Lab on a Chip. 5 (10), 1155-1160 (2005).
  21. Saleh, O. A., Sohn, L. L. Direct detection of antibody-antigen binding using an on-chip artificial pore. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (3), 820-824 (2003).
  22. Saleh, O. A., Sohn, L. L. An artificial nanopore for molecular sensing. Nano Letters. 3 (1), 37-38 (2003).
  23. Saleh, O. A., Sohn, L. L. Quantitative sensing of nanoscale colloids using a microchip Coulter counter. Review of Scientific Instruments. 72 (12), 4449-4451 (2001).
  24. DeBlois, R. W., Bean, C. P. Counting and sizing of submicron particles by the resistive pulse technique. Review of Scientific Instruments. 41 (7), 909-916 (1970).
  25. Li, B., et al. Evaluating sources of technical variability in the mechano-node-pore sensing pipeline and their effect on the reproducibility of single-cell mechanical phenotyping. PLoS ONE. 16 (10), 0258982 (2021).
  26. Zhang, Z. M., Chen, S., Liang, Y. Z. Baseline correction using adaptive iteratively reweighted penalized least squares. Analyst. 135 (5), 1138-1146 (2010).
  27. Alibert, C., Goud, B., Manneville, J. B. Are cancer cells really softer than normal cells. Biology of the Cell. 109 (5), 167-189 (2017).
  28. Fujiwara, I., Zweifel, M. E., Courtemanche, N., Pollard, T. D. Latrunculin A accelerates actin filament depolymerization in addition to sequestering actin monomers. Current Biology. 28 (19), 3183-3192 (2018).
  29. Saleh, O. A. . A novel resistive pulse sensor for biological measurements. , (2003).
  30. Dokukin, M. E., Guz, N. V., Sokolov, I. Quantitative study of the elastic modulus of loosely attached cells in AFM indentation experiments. Biophysical Journal. 104 (10), 2123-2131 (2013).
  31. Li, Q., Lim, C. T., Goh, J. C. H., et al. Probing the elasticity of breast cancer cells using AFM. 13th International Conference on Biomedical Engineering. IFMBE Proceedings. 23, 2122-2125 (2009).
  32. Rother, J., et al. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open Biology. 4 (5), 140046 (2014).
  33. Li, Q., et al. AFM indentation study of breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (4), 609-613 (2008).
  34. Xu, C., et al. Elasticity measurement of breast cancer cells by atomic force microscopy. Proc. SPIE 9230. Twelfth International Conference on Photonics and Imaging in Biology and Medicine. (PIBM 2014). 92300, (2014).
  35. Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 84 (3), 2071-2079 (2003).
  36. Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic force microscopy in characterizing cell mechanics for biomedical applications: A review. IEEE Transactions on Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
  37. Urbanska, M., et al. A comparison of microfluidic methods for high-throughput cell deformability measurements. Nature Methods. 17, 587-593 (2020).
  38. Hill, R. T., Chilkoti, A. Surface Patterning. Biomaterials Science: An Introduction to Materials: Third Edition. , 276-301 (2013).
  39. Wang, Z., Volinsky, A. A., Gallant, N. D. Crosslinking effect on polydimethylsiloxane elastic modulus measured by custom-built compression instrument. Journal of Applied Polymer Science. 131 (22), 41050 (2014).
  40. Gibson, L. J. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).
  41. Stephens, A. D., Banigan, E. J., Adam, S. A., Goldman, R. D., Marko, J. F. Chromatin and lamin a determine two different mechanical response regimes of the cell nucleus. Molecular Biology of the Cell. 28 (14), 1984-1996 (2017).
  42. Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force microscopy of nonadherent cells: A comparison of leukemia cell deformability. Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
  43. Evers, T. M. J., Holt, L. J., Alberti, S., Mashaghi, A. Reciprocal regulation of cellular mechanics and metabolism. Nature Metabolism. 3 (4), 456-468 (2021).
  44. Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing enables label-free surface-marker profiling of single cells. Analytical Chemistry. 87 (5), 2988-2995 (2015).

Tags

Keywords: Mechano-Node-Pore SensingSingle-cell Viscoelastic MeasurementsMicrofluidic PlatformLabel-freeElectronic MeasurementCell MechanicsCell ViscoelasticityCell PhenotypingCell BehaviorDisease ProgressionDrug Response
check_url/64665?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lai, A., Rex, R., Cotner, K. L., Dong, A., Lustig, M., Sohn, L. L. Mechano-Node-Pore Sensing: A Rapid, Label-Free Platform for Multi-Parameter Single-Cell Viscoelastic Measurements. J. Vis. Exp. (190), e64665, doi:10.3791/64665 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image