Piattaforma di chip microfluidici clinici per l'isolamento di cellule tumorali circolanti versatili
Summary
Il chip microfluidico clinico è un’importante tecnica di analisi biomedica che semplifica la pre-elaborazione del campione di sangue del paziente clinico e colora immunofluorescentmente le cellule tumorali circolanti (CTC) in situ sul chip, consentendo la rapida rilevazione e identificazione di un singolo CTC.
Abstract
Le cellule tumorali circolanti (CTC) sono significative nella prognosi del cancro, nella diagnosi e nella terapia antitumorale. L’enumerazione delle CTC è fondamentale per determinare la malattia del paziente poiché le CTC sono rare ed eterogenee. I CTC sono staccati dal tumore primario, entrano nel sistema di circolazione sanguigna e potenzialmente crescono in siti distanti, metastatizzando così il tumore. Poiché le CTC trasportano informazioni simili al tumore primario, l’isolamento delle CTC e la successiva caratterizzazione possono essere fondamentali nel monitoraggio e nella diagnosi del cancro. L’enumerazione, la modifica dell’affinità e la colorazione clinica con immunofluorescenza di CTC rari sono metodi potenti per l’isolamento delle CTC perché forniscono gli elementi necessari con alta sensibilità. I chip microfluidici offrono un metodo di biopsia liquida privo di qualsiasi dolore per i pazienti. In questo lavoro, presentiamo un elenco di protocolli per chip microfluidici clinici, una versatile piattaforma di isolamento CTC, che incorpora una serie di funzionalità e servizi necessari per la separazione, l’analisi e la diagnosi precoce dei CTC, facilitando così l’analisi biomolecolare e il trattamento del cancro. Il programma include il conteggio delle cellule tumorali rare, la pre-elaborazione clinica del sangue del paziente, che include la lisi dei globuli rossi, e l’isolamento e il riconoscimento delle CTC in situ su chip microfluidici. Il programma consente l’enumerazione precisa delle cellule tumorali o CTC. Inoltre, il programma include uno strumento che incorpora l’isolamento CTC con chip microfluidici versatili e l’identificazione dell’immunofluorescenza in situ sui chip, seguita dall’analisi biomolecolare.
Introduction
Le cellule tumorali circolanti (CTC) sono significative nella prognosi del cancro, nella diagnosi e nella terapia antitumorale. L’enumerazione dei CTC è fondamentale poiché i CTC sono rari ed eterogenei. L’enumerazione, la modifica dell’affinità e la colorazione clinica con immunofluorescenza di CTC rare sono tecniche potenti per l’isolamento delle CTC perché offrono gli elementi necessari con alta sensibilità1. Un numero raro di cellule tumorali mescolate con sangue normale imita da vicino il sangue reale del paziente poiché 2-3 ml di sangue reale del paziente contengono solo 1-10 CTC. Per risolvere un problema sperimentale critico, invece di utilizzare un gran numero di cellule tumorali introdotte nella PBS o mescolate con sangue normale, l’uso di un numero raro di cellule tumorali ci fornisce un basso numero di cellule del sangue, che è più vicino alla realtà quando si esegue un esperimento.
Il cancro è la principale causa di morte nel mondo2. Le CTC sono cellule tumorali liberate dal tumore originale che circolano nel sangue e nei sistemi di circolazione linfatica3. Quando i CTC si spostano in un nuovo ambiente di sopravvivenza, crescono come un secondo tumore. Questo è chiamato metastasi ed è responsabile del 90% dei decessi nei pazienti oncologici4. I CTC sono vitali per la prognosi, la diagnosi precoce e per la comprensione dei meccanismi del cancro. Tuttavia, le CTC sono estremamente rare ed eterogenee nel sangue del paziente 5,6.
I chip microfluidici offrono una biopsia liquida che non invade il tumore. Hanno il vantaggio di essere portatili, a basso costo e di avere una bilancia abbinata alle celle. L’isolamento delle CTC con chip microfluidici è classificato principalmente in due tipi: basato sull’affinità, che si basa sul legame antigene-anticorpo 7,8,9 ed è il metodo originale e più utilizzato di isolamento dei CTC; e i chip fisici, che utilizzano differenze di dimensioni e deformabilità tra cellule tumorali e cellule del sangue 10,11,12,13,14,15, sono privi di etichetta e sono facili da usare. Il vantaggio dei chip microfluidici rispetto alle tecniche alternative è che l’approccio basato sulla fisica dei microfiltri a grande ellisse cattura saldamente i CTC con un’elevata efficienza di cattura. La ragione di ciò è che i micropali di ellisse sono organizzati in sottili tunnel di spazi tra linee. Gli spazi tra linee sono diversi dai tradizionali spazi tra punti e punti formati da micropali come i micropali di rombo. L’acquisizione basata su chip wave dei CTC combina sia l’isolamento basato sulle proprietà fisiche che quello basato sull’affinità. L’acquisizione basata su chip d’onda coinvolge 30 array a forma di onda con l’anticorpo anti-EpCAM rivestito su micropali circolari. I CTC vengono catturati dai piccoli spazi vuoti e i grandi spazi vengono utilizzati per accelerare la portata. I CTC mancati devono superare i piccoli spazi vuoti nell’array successivo e vengono catturati dall’isolamento basato sull’affinità integrato all’interno del chip16.
L’obiettivo del protocollo è dimostrare il conteggio di un numero raro di cellule tumorali e l’analisi clinica di CTC con chip microfluidici. Il protocollo descrive le fasi di isolamento CTC, come ottenere un basso numero di cellule tumorali, la separazione fisica clinica dei filtri a piccola ellisse, dei filtri a grande ellisse e dei filtri trapezoidali, la modifica dell’affinità e l’arricchimento17.
Protocol
Representative Results
Discussion
La prognosi e la diagnosi precoce del cancro hanno un effetto significativo sul trattamento del cancro1. L’isolamento CTC con chip microfluidici offre una biopsia liquida senza invasione. Tuttavia, i CTC sono estremamente rari ed eterogenei nel sangue1, il che rende difficile isolare i CTC. I CTC hanno proprietà simili alle fonti tumorali originali da cui provengono. Pertanto, i CTC svolgono un ruolo vitale nelle metastasi del cancro1.
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro di ricerca è stato sostenuto dalla Anhui Natural Science Foundation of China (1908085MF197, 1908085QB66), dalla National Natural Science Foundation of China (21904003), dal Scientific Research Project of Tianjin Education Commission (2018KJ154), dal Provincial Natural Science Research Program of Higher Education Institutions of Anhui Province (KJ2020A0239) e dallo Shanghai Key Laboratory of Multidimensional Information Processing, East China Key Laboratory of Multidimensional Information Elaborazione, East China Normal University (MIP20221).
Materials
| Calcein AM | BIOTIUM | 80011 | |
| calibrated microcapillary pipettes | Sigma- Aldrich | P0799 | |
| CD45-PE | BD Biosciences | 560975 | |
| CK-FITC | BD Biosciences | 347653 | cytokeratin monoclonal antibody |
| DMEM | HyClone | SH30081.05 | |
| fetal bovine serum (FBS) | GIBCO,USA | 26140 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes, Solarbio Corp., China | C0031 | |
| penicillin-streptomycin | Ying Reliable biotechnology, China | ||
| Red blood cells lysis (RBCL) | Solarbio, Beijing | R1010 |
References
- Chen, H., et al. Highly-sensitive capture of circulating tumor cells using micro-ellipse filters. Scientific Reports. 7 (1), 610 (2017).
- . World Health Organization Cancer report Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer (2022)
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature Reviews Cancer. 8 (5), 329-340 (2008).
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: A question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Sollier, E., et al. Size-selective collection of circulating tumor cells using Vortex technology. Lab on a Chip. 14 (1), 63-77 (2014).
- Stott, S. L., et al. Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer. Science Translational Medicine. 2 (25), 23 (2010).
- Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
- Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumor cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Murlidhar, V., et al. A radial flow microfluidic device for ultra-high-throughput affinity-based isolation of circulating tumor cells. Small. 10 (23), 4895-4904 (2014).
- Tan, S. J., Yobas, L., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood. Biomedical Microdevices. 11 (4), 883-892 (2009).
- Preira, P., et al. Passive circulating cell sorting by deformability using a microfluidic gradual filter. Lab on a Chip. 13 (1), 161-170 (2013).
- Yan, S., Zhang, J., Yuan, D., Li, W. Hybrid microfluidics combined with active and passive approaches for continuous cell separation. Electrophoresis. 38 (2), 238-249 (2017).
- Patil, P., Madhuprasad Kumeria, T., Losic, D., Kurkuri, M. Isolation of circulating tumour cells by physical means in a microfluidic device: A review. RSC Advances. 5 (109), 89745-89762 (2015).
- Kumeria, T., et al. Photoswitchable membranes based on peptide-modified nanoporous anodic alumina: Toward smart membranes for on-demand molecular transport. Advanced Materials. 27 (19), 3019-3024 (2015).
- Mahesh, P. B., et al. Recent advances in microfluidic platform for physical and immunological detection and capture of circulating tumor cells. Biosensors. 12 (4), 220 (2022).
- Chen, H., Cao, B., Chen, H., Lin, Y. -. S., Zhang, J. Combination of antibody-coated, physical-based microfluidic chip with wave-shaped arrays for isolating circulating tumor cells. Biomedical Microdevices. 19 (3), 66 (2017).
- Rushton, A. J., Nteliopoulos, G., Shaw, J. A., Coombes, R. C. A review of circulating tumour cell enrichment technologies. Cancers. 13 (5), 970 (2021).
- Chen, H., Zhang, Z. An inertia-deformability hybrid CTC chip: Design, clinical test and numerical study. Journal of Medical Devices. 12 (4), 041004 (2018).
