3D 오가노이드에서 구강-식도 편평 세포 암종 모델링
Summary
이 프로토콜은 화학적 발암을 통해 유도된 정상, 전종양 및 편평 세포 암종 병변을 나타내는 쥐 구강-식도 3D 오가노이드를 생성하고 특성화하는 주요 단계를 설명합니다.
Abstract
식도 편평 세포 암종(ESCC)은 전 세계적으로 널리 퍼져 있으며 매년 모든 식도암 사례의 90%를 차지하며 모든 인간 편평 세포 암종 중에서 가장 치명적입니다. ESCC 시작 및 개발에 수반되는 분자 변화를 정의하는 최근의 진전에도 불구하고 환자의 예후는 여전히 좋지 않습니다. 이러한 분자 변화의 기능적 주석은 필요한 다음 단계이며 ESCC의 분자 특징을 포착하고 기능적 주석을 위해 쉽고 저렴하게 조작할 수 있는 모델이 필요합니다. 담배 연기 모방체 4-니트로퀴놀린 1-옥사이드(4NQO)로 처리된 마우스는 예상대로 ESCC 및 식도 전종양을 형성합니다. 참고로, 4NQO 병변은 구강, 가장 일반적으로 혀와 전위에서도 발생하며, 모두 층화 편평 상피를 공유합니다. 그러나 이러한 마우스는 동종 마우스 모델을 생성하는 데 시간과 리소스가 많이 소요되기 때문에 기능 가설 테스트를 위해 간단히 조작할 수 없습니다. 여기에서 우리는 생체 외에서 쥐 ESCC 또는 전종양 세포를 특성화하기 위해 4NQO로 처리된 마우스에서 단일 세포 유래 3차원(3D) 오가노이드를 생성함으로써 이러한 한계를 극복합니다. 이러한 오가노이드는 ESCC와 식도 전종양의 두드러진 특징을 포착하고, 저렴하고 신속하게 활용하여 동종 모델을 형성할 수 있으며, 동종 이식 실험에 활용할 수 있습니다. 우리는 정상, 전종양 및 SCC 쥐 식도 조직에서 3D 오가노이드를 생성하고 이러한 오가노이드를 유지 및 냉동 보존하는 방법을 보여줍니다. 이러한 다용도 오가노이드의 응용 분야는 광범위하며 유전자 조작 마우스의 활용과 유세포 분석 또는 면역조직화학에 의한 추가 특성 분석, CRISPR 기술을 사용한 동종 오가노이드 라인 생성, 약물 스크리닝 또는 동유전자 이식을 포함합니다. 우리는 이 프로토콜에서 입증된 기술의 광범위한 채택이 ESCC의 심각한 부담을 해결하기 위해 이 분야의 발전을 가속화할 것이라고 믿습니다.
Introduction
식도 편평 세포 암종(ESCC)은 늦은 진단, 치료 저항성 및 전이로 인해 인간 편평 세포 암종 중 가장 치명적입니다 1,2. ESCC는 식도의 내강 표면을 감싸는 층화 편평 상피에서 발생합니다. 편평 상피는 증식성 기저 세포와 기저상 세포층 내의 분화된 세포로 구성됩니다. 생리학적 조건에서 기저 세포는 p63, Sox2, 사이토케라틴 K5 및 K14와 같은 마커를 발현하는 반면 분화된 세포는 K4, K13 및 IVL을 발현합니다. 기저 세포 자체는 이질적이며 K153 및 CD734와 같은 마커에 의해 정의된 추정 줄기 세포를 포함합니다. 항상성에서 기저 세포는 기저 상부 세포층 내에서 유사분열 후 말단 분화를 겪는 반면, 분화된 세포는 내강으로 이동하여 박리되어 상피 재생을 완료합니다. 기원 세포를 연상시키는 ESCC는 다양한 정도로 편평 세포 분화를 나타냅니다. ESCC는 종종 비정형 기저 세포를 포함하는 상피내 종양(IEN) 또는 이형성증으로 알려진 다초점 조직학적 전구체 병변을 동반합니다. 상피 변화 외에도 ESCC는 암 관련 섬유아세포(CAF)의 활성화와 면역/염증 세포의 모집이 일어나 종양 촉진 미세 환경을 조성하는 상피하 구획 내의 조직 리모델링을 표시합니다.
ESCC의 발병기전은 유전적 변화와 환경적 위험 요인에 대한 노출을 포함합니다. 주요 유전적 병변에는 종양 억제 유전자 TP53 및 CDKN2A(p16INK4A)의 비활성화와 CCND1(사이클린 D1) 및 EGFR 종양 유전자의 활성화가 포함되며, 이는 세포 주기 체크포인트 기능 장애, 비정상적인 증식 및 환경 발암 물질에 대한 노출과 관련된 유전독성 스트레스 하에서의 생존을 초래합니다. 실제로 유전 적 변화는 행동 및 환경 적 위험 요소, 가장 일반적으로 담배 및 알코올 사용과 밀접하게 상호 작용합니다. 담배 연기에는 알코올의 주요 대사 산물이기도 한 아세트알데히드와 같은 인체 발암 물질이 포함되어 있습니다. 아세트알데히드는 DNA 부가물과 가닥 간 DNA 가교를 유도하여 DNA 손상과 DNA 돌연변이 및 염색체 불안정성의 축적을 유발합니다. 과도한 유사분열 자극과 종양유전자 활성화로 인한 비정상적인 증식이 주어지면 식도 상피 세포의 악성 형질전환은 항산화제, 자가포식 및 상피-중간엽 전이(EMT)의 활성화를 포함하여 유전독성 스트레스에 대처하는 메커니즘에 의해 촉진됩니다. 흥미롭게도, 이러한 세포 보호 기능은 높은 CD44 (CD44H) 발현을 특징으로하고 종양 개시, 침윤, 전이 및 치료 저항성의 능력을 갖는 ESCC 암 줄기 세포 (CSC)에서 종종 활성화된다 5,6,7.
ESCC는 세포 배양 및 설치류 모델 8,9에서 모델링되었습니다. 지난 삼십 년 동안 ESCC의 강력한 유전자 조작 마우스 모델이 개발되었습니다. 이들은 CCND1 및 EGFR 형질전환 마우스 10,11 및 p53 및 p120 Ctn 녹아웃 마우스 12,13을 포함한다. 그러나 단일 유전적 변화는 일반적으로 빠른 발병 ESCC를 초래하지 않습니다. 이 문제는 ESCC14에서 인간 유전적 병변을 잘 요약하는 식도 발암 물질을 사용하여 극복되었습니다. 예를 들어, 4-니트로퀴놀린-1-옥사이드(4NQO)는 CCND1 형질전환 마우스에서 ESCC 발달을 가속화한다15. 최근 몇 년 동안, 추정되는 식도 상피 줄기 세포, 전구 세포 및 이들의 각각의 운명이 세포 계통 추적 가능한 마우스 모델에서 조사되었습니다 3,4. 또한, 이들 세포계통 추적가능 마우스는 기존의 조직학 및 오믹스 기반 분자 특성 분석을 통해 ESCC의 기원 세포와 이러한 세포가 어떻게 CD44H CSC를 생성하는지 탐색하는 데 활용되어 왔다7.
이러한 마우스 모델과 관련된 새로운 영역 중 하나는 원래 조직의 구조가 생체 외에서 요약되는 3차원(3D) 오가노이드 시스템에서 살아있는 ESCC 및 전구체 세포를 분석하기 위한 세포 배양 기술의 새로운 적용입니다(7,8,9). 이러한 3D 오가노이드는 원발성 및 전이성 종양(예: 림프절, 폐 및 간 병변)을 포함한 쥐 조직에서 분리된 단일 세포 현탁액에서 빠르게 성장합니다. 세포는 기저막 추출물(BME)에 묻혀 잘 정의된 무혈청 세포 배양 배지를 공급합니다. 3D 오가노이드는 7-10일 이내에 성장하며, 생성된 구형 구조는 CSC 마커, EMT, 자가포식, 증식, 분화 및 세포사멸 세포 사멸을 포함한 다양한 세포 특성 및 기능을 분석하기 위한 계대 배양, 냉동 보존 및 분석에 적합합니다.
이러한 방법은 두경부 점막(구강, 혀, 인두 및 후두) 및 심지어 전위와 같은 모든 층화된 편평 상피 조직에서 확립된 3D 오가노이드 배양에 광범위하게 적용될 수 있습니다. 두경부 점막은 식도와 인접해 있으며 두 조직은 유사한 조직 조직, 기능 및 질병에 대한 감수성을 공유합니다. 두경부 편평 세포 암종(HNSCC)과 ESCC는 모두 유전적 병변과 담배 및 알코올 노출과 같은 생활 습관 관련 환경 위험 요소를 공유합니다. 이러한 유사성을 강조하면서, 담배 연기 모방체 4NQO로 처리된 마우스는 HNSCC와 ESCC 모두를 쉽게 발달시킨다. 아래에 설명된 프로토콜이 HNSCC 모델링에 쉽게 적용될 수 있다는 점을 감안할 때 이러한 병변에서 3D 오가노이드 배양을 설정하기 위한 특정 지침이 포함되어 있습니다.
여기에서 우리는 4NQO로 치료된 마우스에서 발생하는 정상, 전종양 및 ESCC 병변을 나타내는 쥐 식도 3D 오가노이드(MEO)를 생성하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. C57BL/6과 같은 일반적인 실험실 균주, 세포 계통 추적 가능 및 기타 유전자 조작 유도체를 포함하여 다양한 마우스 균주를 활용할 수 있습니다. 우리는 정상 또는 병에 걸린 쥐 식도 상피의 분리, 단일 세포 현탁액의 준비, 성장하는 3D 오가노이드의 배양 및 모니터링, 계대 배양, 냉동 보존, 형태학 및 기타 응용 분야를 포함한 후속 분석을 위한 처리를 포함한 주요 단계를 강조합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 프로토콜에서 MEO의 생성 및 분석을 위한 몇 가지 중요한 단계와 고려 사항이 있습니다. MEO 실험에서 재현성과 엄격함을 보장하려면 생물학적 및 기술적 복제가 모두 중요합니다. 생물학적 복제물의 경우, ESCC를 보유하는 2-3개의 독립적인 마우스는 일반적으로 실험 조건당 충분합니다. 그러나 적절한 생물학적 복제 횟수는 개별 연구에서 테스트할 매개변수에 따라 달라질 수 있습니…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
기술 지원을 위해 컬럼비아 대학교 허버트 어빙 종합 암 센터(Herbert Irving Comprehensive Cancer Center)의 공유 리소스(유세포 분석, 분자 병리학, 공초점 및 특수 현미경)에 감사드립니다. 도움이 되는 토론을 해주신 Alan Diehl 박사, Adam J. Bass, Kwok-Kin Wong 박사(NCI P01 식도 발암 메커니즘)와 Rustgi 및 Nakagawa 연구소 구성원에게 감사드립니다. 이 연구는 다음 NIH 보조금의 지원을 받았습니다: P01CA098101(HN 및 AKR), R01DK114436(HN), R01AA026297(HN), L30CA264714(SF), DE031112-01(FMH), KL2TR001874(FCC), 3R01CA255298-01S1(JG), 2L30DK126621-02
(J.G.) R01CA266978 (CL), R01DK132251 (CL), R01DE031873 (CL), P30DK132710 (CM 및 HN) 및 P30CA013696 (AKR). HN과 CL은 Columbia University Herbert Irving Comprehensive Cancer Center Multi-PI Pilot Award를 수상했습니다. HN은 Fanconi Anemia Research Fund Award를 수상했습니다. FMH는 Mark Foundation for Cancer Research Award (20-60-51-MOME)와 American Association for Cancer Research Award를 수상했습니다. J.G.는 미국 위장병 학회 (AGA) 상을 수상했습니다.
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
| 0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
| 21 G needles | BD | 305167 | |
| 24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
| 4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
| Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| Forceps | VWR | 82027-386 | |
| Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
| Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
| Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
| Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
| Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
| Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
| Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
| Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
| RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
| Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
| Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
References
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