modellering av oral-esophageal plateepitelkarsinom i 3D-organoider
Summary
Denne protokollen beskriver de viktigste trinnene for å generere og karakterisere murine oral-esophageal 3D-organoider som representerer normale, preneoplastiske og plateepitelkarsinomlesjoner indusert via kjemisk karsinogenese.
Abstract
Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) er utbredt over hele verden, og står for 90% av alle esophageal cancer tilfeller hvert år, og er den dødeligste av alle humane plateepitelkarsinomer. Til tross for nylige fremskritt i å definere de molekylære endringene som følger med ESCC-initiering og utvikling, er pasientprognosen fortsatt dårlig. Den funksjonelle annotasjonen av disse molekylære endringene er det nødvendige neste trinnet og krever modeller som både fanger de molekylære egenskapene til ESCC og lett og billig kan manipuleres for funksjonell merknad. Mus behandlet med tobakksrøykmimetisk 4-nitrokinolin-1-oksid (4NQO) danner forutsigbart ESCC og esophageal preneoplasi. Merk at 4NQO-lesjoner også oppstår i munnhulen, oftest i tungen, så vel som formagen, som alle deler det stratifiserte plateepitelet. Imidlertid kan disse musene ikke bare manipuleres for funksjonell hypotesetesting, da generering av isogene musemodeller er tid- og ressurskrevende. Her overvinner vi denne begrensningen ved å generere enkeltcellederiverte tredimensjonale (3D) organoider fra mus behandlet med 4NQO for å karakterisere murine ESCC eller preneoplastiske celler ex vivo. Disse organoidene fanger de fremtredende egenskapene til ESCC og esophageal preneoplasi, kan billig og raskt utnyttes for å danne isogene modeller, og kan brukes til syngene transplantasjonseksperimenter. Vi demonstrerer hvordan man genererer 3D-organoider fra normalt, preneoplastisk og SCC murine esophageal vev og vedlikeholder og kryokonserverer disse organoider. Anvendelsene av disse allsidige organoidene er brede og inkluderer bruk av genetisk konstruerte mus og videre karakterisering ved flowcytometri eller immunhistokjemi, generering av isogene organoidlinjer ved bruk av CRISPR-teknologier og legemiddelscreening eller syngen transplantasjon. Vi tror at den utbredte adopsjonen av teknikkene demonstrert i denne protokollen vil akselerere fremgangen på dette feltet for å bekjempe den alvorlige byrden av ESCC.
Introduction
Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) er den dødeligste av humane plateepitelkarsinomer, på grunn av sin sene diagnose, terapiresistens og metastase 1,2. ESCC oppstår fra det stratifiserte plateepitelet, som strekker den luminale overflaten av spiserøret. Det plateepitelet består av proliferative basale celler og differensierte celler i det suprabasale cellelaget. Under fysiologiske forhold uttrykker basalceller markører som p63, Sox2 og cytokeratin K5 og K14, mens differensierte celler uttrykker K4, K13 og IVL. Basalcellene i seg selv er heterogene og inkluderer antatte stamceller definert av markører som K15,3 og CD734. I homeostase gjennomgår basale celler postmitotisk terminal differensiering innenfor det suprabasale cellelaget, mens differensierte celler migrerer og desquamate inn i lumen for å fullføre epitelfornyelse. ESCC minner om deres opprinnelsesceller, og viser plateepiteldifferensiering i varierende grad. ESCC ledsages ofte av multifokale histologiske forløperlesjoner, kjent som intraepitelial neoplasi (IEN) eller dysplasi, som omfatter atypiske basaloidceller. I tillegg til epitelforandringer viser ESCC vevsremodellering i subepitelrommet, hvor aktivering av kreftassosierte fibroblaster (CAF) og rekruttering av immun / inflammatoriske celler finner sted for å fremme det tumorfremmende mikromiljøet.
Patogenesen til ESCC innebærer genetiske endringer og eksponering for miljørisikofaktorer. Viktige genetiske lesjoner inkluderer inaktivering av tumorsuppressorgenene TP53 og CDKN2A (p16INK4A) og aktivering av CCND1 (cyklin D1) og EGFR-onkogener, som kulminerer i nedsatt cellesykluskontrollpunktfunksjon, avvikende proliferasjon og overlevelse under genotoksisk stress relatert til eksponering for miljøkreftfremkallende stoffer. Faktisk samhandler genetiske endringer tett med atferdsmessige og miljømessige risikofaktorer, oftest tobakk og alkoholbruk. Tobakksrøyk inneholder humane kreftfremkallende stoffer som acetaldehyd, som også er hovedmetabolitten av alkohol. Acetaldehyd induserer DNA-addukter og interstrand DNA-kryssbindinger, noe som fører til DNA-skade og akkumulering av DNA-mutasjoner og kromosomal ustabilitet. Gitt overdreven mitogen stimuli og avvikende proliferasjon fra onkogenaktivering, blir den ondartede transformasjonen av esophageal epitelceller lettere av mekanismer for å takle genotoksisk stress, inkludert aktivering av antioksidanter, autofagi og epitel-mesenkymal overgang (EMT). Interessant nok aktiveres disse cytoprotektive funksjonene ofte i ESCC-kreftstamceller (CSC) som er preget av høyt CD44 (CD44H) uttrykk og har evnen til tumorinitiering, invasjon, metastase og terapiresistens 5,6,7.
ESCC har blitt modellert i cellekultur og i gnagermodeller 8,9. I løpet av de siste tre tiårene har robuste genmodifiserte musemodeller av ESCC blitt utviklet. Disse inkluderer CCND1 og EGFR transgene mus 10,11 og p53 og p120Ctn knockout mus 12,13. Imidlertid resulterer enkle genetiske endringer vanligvis ikke i raskt innsettende ESCC. Denne utfordringen har blitt overvunnet med bruk av esophageal carcinogens som rekapitulerer godt de menneskelige genetiske lesjonene i ESCC14. For eksempel akselererer 4-nitrokinolin-1-oksid (4NQO) ESCC-utvikling i CCND1 transgene mus15. I de senere år har antatte esophageal epitelial stamceller, stamceller og deres respektive skjebner blitt undersøkt i celleavstamningssporbare musemodeller 3,4. Videre har disse celleavstamningssporbare musene blitt brukt til å utforske opprinnelsescellene til ESCC og hvordan slike celler gir opphav til CD44H CSC via konvensjonell histologi og omics-basert molekylær karakterisering7.
Et fremvoksende område relatert til disse musemodellene er den nye anvendelsen av cellekulturteknikker for å analysere levende ESCC og forløperceller i et tredimensjonalt (3D) organoidsystem der arkitekturen til det opprinnelige vevet rekapituleres ex vivo 7,8,9. Disse 3D-organoider vokser raskt fra en enkeltcellesuspensjon isolert fra murine vev, inkludert primære og metastaserende svulster (f.eks. Lymfeknute, lunge og leverskader). Cellene er innebygd i kjellermembranekstrakt (BME) og matet med et veldefinert serumfritt cellekulturmedium. 3D-organoidene vokser innen 7-10 dager, og de resulterende sfæriske strukturer er egnet for subkultur, kryopreservering og analyser for å analysere en rekke cellulære egenskaper og funksjoner, inkludert CSC-markører, EMT, autofagi, spredning, differensiering og apoptotisk celledød.
Disse metodene kan i stor grad brukes på 3D-organoidkulturer etablert fra ethvert stratifisert plateepitelvev, for eksempel hode- og nakkeslimhinnen (munnhule, tunge, svelg og strupehode) og til og med formagen. Hode- og nakkeslimhinnen er sammenhengende med spiserøret, og de to vevene deler lignende vevsorganisasjon, funksjon og følsomhet for sykdom. Både hode- og nakkeplateepitelkarsinom (HNSCC) og ESCC deler genetiske lesjoner og livsstilsrelaterte miljørisikofaktorer som tobakk og alkoholeksponering. For å understreke denne likheten, utvikler mus behandlet med tobakksrøykmimetikken 4NQO lett både HNSCC og ESCC. Gitt hvor enkelt protokollene beskrevet nedenfor kan brukes til modellering av HNSCC, inkluderer vi spesifikke instruksjoner for å etablere 3D-organoidkulturer fra disse lesjonene.
Her gir vi detaljerte protokoller for generering av murine esophageal 3D organoider (MEOs) som representerer normale, preneoplastiske og ESCC lesjoner som utvikler seg hos mus behandlet med 4NQO. Ulike musestammer kan benyttes, inkludert vanlige laboratoriestammer som C57BL / 6 og cellelinjesporbare og andre genetisk konstruerte derivater. Vi legger vekt på de viktigste trinnene, inkludert isolering av normalt eller sykt murine esophageal epitel, fremstilling av encellede suspensjoner, dyrking og overvåking av voksende 3D-organoider, subkultur, kryopreservering og behandling for påfølgende analyser, inkludert morfologi og andre applikasjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er flere kritiske trinn og hensyn til generering og analyse av MEOer i protokollene beskrevet her. For å sikre reproduserbarhet og strenghet i MEO-eksperimenter er både biologiske og tekniske replikater viktige. For biologiske replikater er to til tre uavhengige mus som bærer ESCC generelt tilstrekkelig per eksperimentell tilstand. Imidlertid kan riktig antall biologiske replikater variere avhengig av parametrene som skal testes i individuelle studier. For eksempel er det foreløpig ukjent hvor tidlig og hvor ofte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker de delte ressursene (flowcytometri, molekylær patologi og konfokal og spesialisert mikroskopi) ved Herbert Irving Comprehensive Cancer Center ved Columbia University for teknisk støtte. Vi takker Dr. Alan Diehl, Adam J. Bass og Kwok-Kin Wong (NCI P01 Mechanisms of Esophageal Carcinogenesis) og medlemmer av Rustgi og Nakagawa laboratorier for nyttige diskusjoner. Denne studien ble støttet av følgende NIH Grants: P01CA098101 (H.N. og A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(J.G.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. og H.N.) og P30CA013696 (A.K.R.). H.N. og C.L. er mottakere av Columbia University Herbert Irving Comprehensive Cancer Center Multi-PI Pilot Award. H.N. er mottaker av Fanconi Anemia Research Fund Award. FMH er mottaker av The Foundation for Cancer Research Award (20-60-51-MOME) og en American Association for Cancer Research Award. J.G. er mottaker av American Gastroenterological Association (AGA)-prisen.
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
| 0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
| 21 G needles | BD | 305167 | |
| 24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
| 4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
| Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| Forceps | VWR | 82027-386 | |
| Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
| Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
| Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
| Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
| Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
| Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
| Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
| Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
| RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
| Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
| Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
References
- Rustgi, A. K., El-Serag, H. B. Esophageal carcinoma. The New England Journal of Medicine. 371 (26), 2499-2509 (2014).
- Dotto, G. P., Rustgi, A. K. Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics. Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).
- Giroux, V., et al. Long-lived keratin 15+ esophageal progenitor cells contribute to homeostasis and regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2378-2391 (2017).
- DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).
- Kinugasa, H., et al. Mitochondrial SOD2 regulates epithelial-mesenchymal transition and cell populations defined by differential CD44 expression. Oncogene. 34 (41), 5229-5239 (2015).
- Whelan, K. A., et al. Autophagy supports generation of cells with high CD44 expression via modulation of oxidative stress and Parkin-mediated mitochondrial clearance. Oncogene. 36 (34), 4843-4858 (2017).
- Natsuizaka, M., et al. Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma. Nature Communications. 8 (1), 1758 (2017).
- Whelan, K. A., Muir, A. B., Nakagawa, H. Esophageal 3D culture systems as modeling tools in esophageal epithelial pathobiology and personalized medicine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 461-478 (2018).
- Sachdeva, U. M., et al. Understanding the cellular origin and progression of esophageal cancer using esophageal organoids. Cancer Letters. 509, 39-52 (2021).
- Nakagawa, H., et al. The targeting of the cyclin D1 oncogene by an Epstein-Barr virus promoter in transgenic mice causes dysplasia in the tongue, esophagus and forestomach. Oncogene. 14 (10), 1185-1190 (1997).
- Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 278 (3), 1824-1830 (2003).
- Opitz, O. G., et al. A mouse model of human oral-esophageal cancer. The Journal of Clinical Investigation. 110 (6), 761-769 (2002).
- Stairs, D. B., et al. Deletion of p120-catenin results in a tumor microenvironment with inflammation and cancer that establishes it as a tumor suppressor gene. Cancer Cell. 19 (4), 470-483 (2011).
- Tang, X. -. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10, 301-313 (2004).
- Fong, L. Y. Y., Mancini, R., Nakagawa, H., Rustgi, A. K., Huebner, K. Combined cyclin D1 overexpression and zinc deficiency disrupts cell cycle and accelerates mouse forestomach carcinogenesis. Cancer Research. 63 (14), 4244-4252 (2003).
- Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440 (2021).
- Hisha, H., et al. Establishment of a novel lingual organoid culture system: generation of organoids having mature keratinized epithelium from adult epithelial stem cells. Scientific Reports. 3, 3224 (2013).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Nguyen, N., et al. TGF-β1 alters esophageal epithelial barrier function by attenuation of claudin-7 in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunology. 11 (2), 415-426 (2018).
- Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes and Immunity. 15 (6), 361-369 (2014).
- Ruffner, M. A., et al. Toll-like receptor 2 stimulation augments esophageal barrier integrity. Allergy. 74 (12), 2449-2460 (2019).
- Kabir, M. F., et al. Single cell transcriptomic analysis reveals cellular diversity of murine esophageal epithelium. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Shimonosono, M., et al. Alcohol metabolism enriches squamous cell carcinoma cancer stem cells that survive oxidative stress via autophagy. Biomolecules. 11 (10), 1479 (2021).
- Flashner, S., Yan, K. S., Nakagawa, H. 3D organoids: An untapped platform for studying host-microbiome interactions in esophageal cancers. Microorganisms. 9 (11), 2182 (2021).
- Liu, K., et al. Sox2 cooperates with inflammation-mediated stat3 activation in the malignant transformation of foregut basal progenitor cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 304-315 (2013).
