Modellazione del carcinoma a cellule squamose orale-esofagea in organoidi 3D
Summary
Questo protocollo descrive i passaggi chiave per generare e caratterizzare organoidi 3D orali-esofagei murini che rappresentano lesioni da carcinoma a cellule squamose normali, preneoplastiche e squamose indotte tramite carcinogenesi chimica.
Abstract
Il carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC) è prevalente in tutto il mondo, rappresentando il 90% di tutti i casi di cancro esofageo ogni anno ed è il più mortale di tutti i carcinomi a cellule squamose umane. Nonostante i recenti progressi nella definizione dei cambiamenti molecolari che accompagnano l’inizio e lo sviluppo dell’ESCC, la prognosi del paziente rimane sfavorevole. L’annotazione funzionale di questi cambiamenti molecolari è il passo successivo necessario e richiede modelli che catturino le caratteristiche molecolari dell’ESCC e possano essere manipolati in modo semplice ed economico per l’annotazione funzionale. I topi trattati con il fumo di tabacco mimetico 4-nitrochinolina 1-ossido (4NQO) formano prevedibilmente ESCC e preneoplasia esofagea. Da notare che le lesioni 4NQO insorgono anche nella cavità orale, più comunemente nella lingua, così come nel prestomaco, che condividono tutti l’epitelio squamoso stratificato. Tuttavia, questi topi non possono essere semplicemente manipolati per il test di ipotesi funzionali, poiché la generazione di modelli murini isogeni richiede molto tempo e risorse. Qui, superiamo questa limitazione generando organoidi tridimensionali (3D) derivati da singole cellule da topi trattati con 4NQO per caratterizzare ESCC murino o cellule preneoplastiche ex vivo. Questi organoidi catturano le caratteristiche salienti dell’ESCC e della preneoplasia esofagea, possono essere sfruttati in modo economico e rapido per formare modelli isogeni e possono essere utilizzati per esperimenti di trapianto singeneico. Dimostriamo come generare organoidi 3D da tessuto esofageo murino normale, preneoplastico e SCC e mantenere e crioconservare questi organoidi. Le applicazioni di questi organoidi versatili sono ampie e includono l’utilizzo di topi geneticamente modificati e l’ulteriore caratterizzazione mediante citometria a flusso o immunoistochimica, la generazione di linee di organoidi isogeneici utilizzando le tecnologie CRISPR e lo screening farmacologico o il trapianto singeneico. Riteniamo che l’adozione diffusa delle tecniche dimostrate in questo protocollo accelererà i progressi in questo campo per combattere il grave onere dell’ESCC.
Introduction
Il carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC) è il più letale dei carcinomi a cellule squamose umane, a causa della sua diagnosi tardiva, della resistenza alla terapia e delle metastasi 1,2. L’ESCC nasce dall’epitelio squamoso stratificato, che riveste la superficie luminale dell’esofago. L’epitelio squamoso è composto da cellule basali proliferative e cellule differenziate all’interno dello strato cellulare soprabasale. In condizioni fisiologiche, le cellule basali esprimono marcatori come p63, Sox2 e citocheratina K5 e K14, mentre le cellule differenziate esprimono K4, K13 e IVL. Le cellule basali stesse sono eterogenee e includono cellule staminali putative definite da marcatori come K153 e CD734. Nell’omeostasi, le cellule basali subiscono una differenziazione terminale post-mitotica all’interno dello strato cellulare soprabasale, mentre le cellule differenziate migrano e si desquamano nel lume per completare il rinnovamento epiteliale. Ricordando le loro cellule di origine, ESCC mostra la differenziazione delle cellule squamose a vari livelli. L’ESCC è spesso accompagnata da lesioni precursori istologiche multifocali, note come neoplasia intraepiteliale (IEN) o displasia, comprendenti cellule basaloidi atipiche. Oltre ai cambiamenti epiteliali, ESCC mostra il rimodellamento tissutale all’interno del compartimento subepiteliale, dove avviene l’attivazione dei fibroblasti associati al cancro (CAF) e il reclutamento di cellule immunitarie / infiammatorie per favorire il microambiente che promuove il tumore.
La patogenesi dell’ESCC comporta cambiamenti genetici ed esposizione a fattori di rischio ambientali. Le lesioni genetiche chiave includono l’inattivazione dei geni oncosoppressori TP53 e CDKN2A (p16INK4A) e l’attivazione degli oncogeni CCND1 (ciclina D1) e EGFR, che culminano nella compromissione della funzione del checkpoint del ciclo cellulare, nella proliferazione aberrante e nella sopravvivenza sotto stress genotossico correlato all’esposizione ad agenti cancerogeni ambientali. In effetti, i cambiamenti genetici interagiscono strettamente con i fattori di rischio comportamentali e ambientali, più comunemente l’uso di tabacco e alcol. Il fumo di tabacco contiene agenti cancerogeni per l’uomo come l’acetaldeide, che è anche il principale metabolita dell’alcol. L’acetaldeide induce addotti del DNA e legami incrociati del DNA tra filamenti, portando a danni al DNA e all’accumulo di mutazioni del DNA e instabilità cromosomica. Dati gli eccessivi stimoli mitogenici e la proliferazione aberrante dall’attivazione dell’oncogene, la trasformazione maligna delle cellule epiteliali esofagee è facilitata da meccanismi per far fronte allo stress genotossico, tra cui l’attivazione di antiossidanti, l’autofagia e la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT). È interessante notare che queste funzioni citoprotettive sono spesso attivate nelle cellule staminali tumorali ESCC (CSC) che sono caratterizzate da un’elevata espressione di CD44 (CD44H) e hanno le capacità di inizio del tumore, invasione, metastasi e resistenza alla terapia 5,6,7.
L’ESCC è stato modellato in coltura cellulare e in roditori modello 8,9. Negli ultimi tre decenni, sono stati sviluppati robusti modelli murini geneticamente modificati di ESCC. Questi includono topi transgenici CCND1 e EGFR 10,11 e topi knockout p53 e p120Ctn 12,13. Tuttavia, i singoli cambiamenti genetici non provocano in genere ESCC a insorgenza rapida. Questa sfida è stata superata con l’uso di agenti cancerogeni esofagei che ricapitolano bene le lesioni genetiche umane in ESCC14. Ad esempio, la 4-nitrochinolina-1-ossido (4NQO) accelera lo sviluppo di ESCC nei topi transgenici CCND1 15. Negli ultimi anni, le cellule staminali epiteliali esofagee putative, le cellule progenitrici e i loro rispettivi destini sono stati studiati in modelli murini tracciabili dalla linea cellulare 3,4. Inoltre, questi topi tracciabili dalla linea cellulare sono stati utilizzati per esplorare le cellule di origine dell’ESCC e come tali cellule danno origine alle CSC CD44H attraverso l’istologia convenzionale e la caratterizzazione molecolare basata sull’omiche7.
Un’area emergente correlata a questi modelli murini è la nuova applicazione di tecniche di coltura cellulare per analizzare ESCC vivi e cellule precursori in un sistema organoide tridimensionale (3D) in cui l’architettura dei tessuti originali è ricapitolata ex vivo 7,8,9. Questi organoidi 3D sono rapidamente cresciuti da una sospensione unicellulare isolata da tessuti mrini, compresi i tumori primari e metastatici (ad esempio, lesioni linfonodali, polmonari ed epatiche). Le cellule sono incorporate nell’estratto di membrana basale (BME) e alimentate con un mezzo di coltura cellulare privo di siero ben definito. Gli organoidi 3D crescono entro 7-10 giorni e le strutture sferiche risultanti sono suscettibili di sottocoltura, crioconservazione e saggi per analizzare una varietà di proprietà e funzioni cellulari, tra cui marcatori CSC, EMT, autofagia, proliferazione, differenziazione e morte cellulare apoptotica.
Questi metodi possono essere ampiamente applicati a colture di organoidi 3D stabilite da qualsiasi tessuto epiteliale squamoso stratificato, come la mucosa della testa e del collo (cavità orale, lingua, faringe e laringe) e persino il prestomaco. La mucosa della testa e del collo sono contigue all’esofago e i due tessuti condividono organizzazione, funzione e suscettibilità alle malattie dei tessuti simili. Sia il carcinoma a cellule squamose della testa che del collo (HNSCC) e l’ESCC condividono lesioni genetiche e fattori di rischio ambientali legati allo stile di vita come l’esposizione al tabacco e all’alcol. Sottolineando questa somiglianza, i topi trattati con il fumo di tabacco mimetico 4NQO sviluppano prontamente sia HNSCC che ESCC. Data la facilità con cui i protocolli descritti di seguito possono essere applicati alla modellazione HNSCC, includiamo istruzioni specifiche per stabilire colture di organoidi 3D da queste lesioni.
Qui, forniamo protocolli dettagliati per la generazione di organoidi 3D esofagei murini (MEO) che rappresentano lesioni normali, preneoplastiche e ESCC che si sviluppano in topi trattati con 4NQO. Possono essere utilizzati vari ceppi di topo, compresi ceppi di laboratorio comuni come C57BL / 6 e derivati tracciabili e altri derivati geneticamente modificati tracciabili dalla linea cellulare. Sottolineiamo i passaggi chiave, tra cui l’isolamento dell’epitelio esofageo murino normale o malato, la preparazione di sospensioni unicellulari, la coltivazione e il monitoraggio degli organoidi 3D in crescita, la sottocoltura, la crioconservazione e l’elaborazione per analisi successive, compresa la morfologia e altre applicazioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono diversi passaggi critici e considerazioni per la generazione e l’analisi dei MEO nei protocolli qui descritti. Per garantire la riproducibilità e il rigore negli esperimenti MEO, le repliche biologiche e tecniche sono entrambe importanti. Per le repliche biologiche, due o tre topi indipendenti portatori di ESCC sono generalmente sufficienti per condizione sperimentale. Tuttavia, il numero appropriato di repliche biologiche può variare a seconda dei parametri da testare nei singoli studi. Ad esempio, non è attu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo le risorse condivise (citometria a flusso, patologia molecolare e microscopia confocale e specializzata) presso l’Herbert Irving Comprehensive Cancer Center della Columbia University per il supporto tecnico. Ringraziamo i dottori Alan Diehl, Adam J. Bass e Kwok-Kin Wong (NCI P01 Mechanisms of Esophageal Carcinogenesis) e i membri dei laboratori Rustgi e Nakagawa per le utili discussioni. Questo studio è stato supportato dai seguenti NIH Grants: P01CA098101 (H.N. e A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(G.J.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. e H.N.) e P30CA013696 (A.K.R.). H.N. e C.L. hanno ricevuto il premio pilota multi-PI della Columbia University Herbert Irving Comprehensive Cancer Center. H.N. ha ricevuto il Fanconi Anemia Research Fund Award. F.M.H. ha ricevuto il premio The Mark Foundation for Cancer Research Award (20-60-51-MOME) e un American Association for Cancer Research Award. J.G. ha ricevuto il premio American Gastroenterological Association (AGA).
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
| 0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
| 21 G needles | BD | 305167 | |
| 24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
| 4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
| Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| Forceps | VWR | 82027-386 | |
| Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
| Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
| Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
| Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
| Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
| Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
| Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
| Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
| RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
| Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
| Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
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