Скрининг сперматозоидов для быстрого выделения изменений зародышевой линии у рыбок данио-рерио
Summary
Технологии CRISPR-Cas произвели революцию в области редактирования генома. Тем не менее, поиск и изоляция желаемого редактирования зародышевой линии остается основным узким местом. Таким образом, в этом протоколе описывается надежный метод быстрого скрининга сперматозоидов рыбок данио, вводимых с помощью F0 CRISPR, на предмет редактирования зародышевой линии с использованием стандартных методов ПЦР, рестрикционного дайджеста и гель-электрофореза.
Abstract
Появление целевых нуклеазных технологий CRISPR-Cas произвело революцию в способности выполнять точное редактирование генома как в устоявшихся, так и в новых модельных системах. Системы редактирования генома CRISPR-Cas используют синтетическую направляющую РНК (sgRNA) для нацеливания CRISPR-ассоциированной (Cas) эндонуклеазы на конкретные локусы геномной ДНК, где эндонуклеаза Cas генерирует двухцепочечный разрыв. Восстановление двухцепочечных разрывов внутренними механизмами, подверженными ошибкам, приводит к вставкам и/или делециям, нарушая локус. В качестве альтернативы, включение двухцепочечных доноров ДНК или одноцепочечных олигонуклеотидов ДНК в этот процесс может вызвать включение точных изменений генома, начиная от однонуклеотидных полиморфизмов и заканчивая небольшими иммунологическими метками или даже большими флуоресцентными белковыми конструкциями. Однако основным узким местом в этой процедуре может быть поиск и изоляция нужного редактирования в зародышевой линии. В этом протоколе изложен надежный метод скрининга и выделения мутаций зародышевой линии в определенных локусах у Danio rerio (рыбки данио); Тем не менее, эти принципы могут быть адаптированы в любой модели, где возможен сбор спермы in vivo .
Introduction
Система CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas является мощным инструментом для выполнения локус-специфического мутагенеза и точного редактирования генома в модельной системе Danio rerio (рыбки данио) 1,2,3,4. Cas-рибонуклеопротеин (RNP) состоит из двух основных компонентов: эндонуклеазы Cas (обычно Cas9 или Cas12a) и локус-специфической синтетической направляющей РНК (sgRNA)5. Вместе Cas-RNP генерирует двухцепочечный разрыв (DSB) в желаемом локусе, который может быть восстановлен одним из двух внутренних механизмов репарации. Механизм репарации негомологичного соединения концов (NHEJ) подвержен ошибкам и часто приводит к различным вставкам или делециям (инделам) вокруг DSB. Эти инделы могут быть вредными, если они вносят мутацию со сдвигом рамки или преждевременную остановку в результирующей белковой последовательности. В качестве альтернативы, механизм гомологической репарации (HDR) использует донорский шаблон с областями гомологии, окружающими сайт DSB, для восстановления повреждения. Исследователи могут воспользоваться преимуществами системы HDR для создания точных геномных правок. В частности, они могут совместно вводить двухцепочечную донорскую конструкцию ДНК, которая содержит желаемые изменения, а также области гомологии, фланкирующие сайт DSB в геноме. Возросшая экономия за счет масштаба этих коммерчески производимых компонентов CRISPR значительно снизила барьеры для скрининга нескольких локусов и создания более масштабных усилий для точного редактирования генома. Однако в моделях животных, размножающихся половым путем, основным узким местом является идентификация и изоляция устойчивых к зародышевой линии мутантных животных.
Модельная система рыбок данио-рерио демонстрирует несколько ключевых качеств, которые расширяют ее использование в обратных генетических исследованиях. Их легко выращивать в больших количествах с помощью основного оборудования для содержания в воде, а самки демонстрируют высокую плодовитость круглый год6. Более того, их внешняя яйцекладка и оплодотворение делают их поддающимися микроинъекциям компонентов CRISPR/Cas. Cas-RNP обычно вводят эмбрионам рыбок данио-рерио на одной клеточной стадии для генерации DSB / репарации, которая теоретически наследуется всеми дочерними клетками. Однако диплоидные геномы требуют двух событий DSB/репарации для мутагенизации обеих гомологичных хромосом. Кроме того, несмотря на то, что Cas-RNP вводится на стадии одной клетки, DSB / репарация может не произойти до более поздних точек развития. Вместе эти факторы способствуют мозаичной природе рыбы, введенной в F0. Распространенной практикой является скрещивание рыбы, введенной в F0, и проверка потомства F1 на наличие инделов / специфических правок. Однако, поскольку не все рыбы, введенные в F0, обладают мутациями зародышевой линии, эта практика приводит к множеству непродуктивных скрещиваний, которые не приводят к желаемому редактированию. Скрининг зародышевой линии F0, а не соматической ткани F1 увеличивает вероятность выделения желаемого редактирования зародышевой линии и уменьшает количество животных, необходимых в этом процессе.
Сперма может быть легко собрана у рыбок данио-рерио с инъекцией F0 без необходимости эвтаназии. Эта функция позволяет криоконсервировать и извлекать замороженные запасы спермы7, но также может быть использована для быстрого скрининга, идентификации и изоляции носителей зародышевой линии желаемых геномных мутаций 8,9. Brocal et al. (2016) ранее описали основанный на секвенировании метод скрининга изменений зародышевой линии у самцов рыбокданио-рерио 10, введенных в F0. Несмотря на то, что этот подход полезен для идентификации мутировавших аллелей, присутствующих в зародышевой линии, он может стать дорогостоящим при высокой пропускной способности и может быть доступен не для всех лабораторий. В отличие от этого, текущий протокол предлагает доступную и экономически эффективную стратегию на основе электрофореза для выявления правок зародышевой линии. В частности, в этом протоколе описывается надежный метод скрининга и выделения мутаций зародышевой линии в определенных локусах с использованием электрофореза в агарозном геле высокого разрешения. Кроме того, в этом протоколе описывается аналогичная стратегия выявления успешной интеграции донорской конструкции, содержащей конкретные изменения. Как всегда, если требуются конкретные изменения, стратегии на основе секвенирования могут быть выполнены в тандеме с протоколом, описанным ниже. Хотя этот протокол специфичен для модельной системы рыбок данио, эти принципы должны быть адаптированы к любой модели, в которой сбор спермы является рутинной процедурой. Вместе эти стратегии позволят идентифицировать мужчин, введенных в F0, с зародышевыми инделами/правками, которые могут быть разрешены на геле после стандартной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и/или рестрикционного дайджеста.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает метод быстрой характеристики предполагаемых изменений генома или целевых мутаций с использованием технологии CRISPR-Cas путем целенаправленного анализа мужских геномов сперматозоидов F0. Этот протокол должен быть совместим с другими моделями животных, где сперма …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Анну Хайндес из Медицинской школы Вашингтонского университета за ее первоначальные усилия по получению геномной ДНК сперматозоидов хорошего качества с использованием метода горячего выстрела. Эта работа была профинансирована Национальным институтом артрита, скелетно-мышечных и кожных заболеваний Национального института здравоохранения в рамках премии (R01AR072009 для R.S.G.).
Materials
| Agarose powder | Fisher BioReagents | BP1356-100 | |
| Breeding tanks | Carolina Biological | 161937 | |
| BstNI Restriction Enzyme | NEB | R0168S | |
| Cas9 Endonuclease | IDT | 1081060 | |
| DNA Ladder, 100 bp | Thermo Scientific | FERSM0241 | |
| dnah10 donor construct | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3') |
|
| dnah10 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') |
|
| dnah10 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') |
|
| dnah10 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3' | |
| Electrophoresis power supply | Thermo Scientific | 105ECA-115 | |
| Filter forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Fish (system) water | Generic | n/a | |
| Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber) | Thermo Scientific | B2 | |
| Gel imaging light box | Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| Gel stain, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| Glass bowl, 250 mL | Generic | n/a | |
| Isolation tanks, 0.8 L | Aquaneering | ZT080 | |
| Microcap capillary tube with bulb, 20 µL | Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Minicentrifuge | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Micropipettes, various with appropriate tips | Generic | n/a | |
| Microwave | Generic | n/a | |
| Nuclease free water | Promega | P119-C | |
| Paper towels | Generic | n/a | |
| PCR tubes, 0.2 mL | Bioexpress | T-3196-1 | |
| Plastic spoon, with drilled holes/slots | Generic | n/a | |
| KCl solution, 0.2 M RNAse Free | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') |
|
| p2ry12 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') |
|
| p2ry12 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3' | |
| Restriction Enzyme 10X Buffer | NEB | B6003SVIAL | |
| NaOH solution, 50 mM | Thermo Scientific | S318; 424330010 | |
| Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot | Generic | n/a | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq polymerase master mix, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Buffer Concentrate, 10X | VWR | E442 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tissue paper | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0) | Promega | H5131 |
References
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Troutwine, B. R., et al. The Reissner fiber is highly dynamic in vivo and controls morphogenesis of the spine. Current Biology. 30 (12), 2353-2362 (2020).
- Xu, Y., Li, Z. CRISPR-Cas systems: Overview, innovations and applications in human disease research and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2401-2415 (2020).
- Creaser, C. W. The technic of handling the zebrafish (Brachydanio rerio) for the production of eggs which are favorable for embryological research and are available at any specified time throughout the year. Copeia. 1930 (4), 159-161 (1934).
- Carmichael, C., Westerfiel, M., Varga, Z. M. Cryopreservatin and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods in Molecular Biology. 546, 45-65 (2009).
- Wang, Y., Troutwine, B. R., Zhang, H., Gray, R. S. The axonemal dynein heavy chain 10 gene is essential for monocilia motility and spine alignment in zebrafish. Developmental Biology. 482, 82-90 (2021).
- Gray, R. S., et al. Postembryonic screen for mutations affecting spine development in zebrafish. Developmental Biology. 471, 18-33 (2021).
- Brocal, I., et al. Efficient identification of CRISPR/Cas9-induced insertions/deletions by direct germline screening in zebrafish. BMC Genomics. 17, 259 (2016).
- Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, A Plasmid Editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Frontiers in Bioinformatics. 2, 816619 (2022).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Hill, J. T., et al. Poly Peak Parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Liu, Q., et al. Hi-TOM: A platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems. Science China. Life Sciences. 62 (1), 1-7 (2019).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
