다공성 매체의 생물 막힘을 연구하기 위한 미세유체 플랫폼
Summary
본 프로토콜은 고해상도 현미경 이미징과 동시 압력 차이 측정을 결합하여 준 2D 다공성 배지에서 생물막 발달을 연구하는 미세 유체 플랫폼을 설명합니다. 이 플랫폼은 다공성 매체의 공극 크기와 유체 유속이 생물 막힘에 미치는 영향을 정량화합니다.
Abstract
박테리아 생물막은 토양 및 여과막을 포함한 여러 환경 및 산업 다공성 매체에서 발견됩니다. 생물막은 특정 유동 조건에서 자라며 기공을 막아 국소 유체 흐름을 리디렉션할 수 있습니다. 생물막이 기공을 막는 능력, 이른바 생물막힘은 다공성 매질의 국부 투과성에 엄청난 영향을 미쳐 시스템에 압력 상승을 일으키고 이를 통과하는 질량 흐름에 영향을 줄 수 있습니다. 상이한 물리적 조건(예를 들어, 상이한 유속 및 공극 크기에서)하에서 생물막 성장과 유체 유동 사이의 상호작용을 이해하기 위해, 본 연구에서, 미세유체 플랫폼은 외부에서 부과되고 제어된 물리적 조건 하에서 현미경을 사용하여 생물막 발달을 시각화하기 위해 개발된다. 다공성 매질의 생물막 유도 압력 축적은 압력 센서를 사용하여 동시에 측정할 수 있으며, 나중에 생물막의 표면 커버리지와 상관관계가 있습니다. 제시된 플랫폼은 유동 조건에서 다공성 매체의 생물막으로 인한 생물막을 조사하기 위한 체계적인 접근 방식의 기준선을 제공하며 환경 분리주 또는 다종 생물막 연구에 적용할 수 있습니다.
Introduction
생물막(biofilm) – 엑스트라 폴리머 물질(extra-polymeric substances, EPS)의 자가 분비 매트릭스에 포매된 박테리아 집락 – 은 토양 및 대수층1과 같은 천연 다공성 매체와 생물 정화(bioremediation)2, 물 여과(water filtration)3 및 의료 기기(medical devices)4와 같은 기술 및 의료 응용 분야에서 흔히 볼 수 있다. 생물막 기질은 다당류, 단백질 섬유, 세포외 DNA(extracellular DNA)5,6로 구성되어 있으며, 미생물, 영양소의 가용성, 환경 조건에 따라 크게 좌우된다7. 그러나 매트릭스의 기능은 보편적입니다. 생물막 구조의 스캐폴드를 형성하고, 기계적 및 화학적 응력으로부터 미생물 군집을 보호하며, 생물막의 유변학적 특성에 크게 기여한다5.
다공성 매질에서 생물막의 성장은 모공을 막아 소위 생물 막힘을 유발할 수 있습니다. 생물막 발달은 다공성 매질의 두 기둥을 분리하는 거리로 정의되는 유체 흐름 및 기공 크기에 의해 제어됩니다 8,9,10. 기공 크기와 유체 흐름은 모두 영양소 수송과 국소 전단력을 제어합니다. 차례로, 성장하는 생물막은 기공을 막고, 유체(11,12,13)의 속도 분포, 질량 수송, 및 다공성 매질(14,15)의 수압 전도도에 영향을 미친다. 유압 전도도의 변화는 밀폐 시스템(16,17,18,19)의 압력 증가를 통해 반영됩니다. 생물막 발달 및 생물막힘에 대한 현재의 미세유체 연구는 균질한 기하학적 구조(즉, 단일 기공 크기) 또는 이질적인 다공성 매체(12,21,22)에서 유속의 영향을 연구하는 데 중점을 둡니다. 그러나 생물막 발달에 대한 유속 및 공극 크기의 영향과 그에 따른 생물 막힌 다공성 배지의 압력 변화를 풀기 위해서는 다양한 다공성 배지 형상 및 환경 조건을 병렬로 연구할 수 있는 고도로 제어 가능하고 다재다능한 실험 플랫폼이 필요합니다.
본 연구는 압력 측정과 다공성 매질 내에서 진화하는 생물막의 동시 이미징을 결합한 미세유체 플랫폼을 소개합니다. 채널 형상 설계의 가스 투과성, 생체 적합성 및 유연성으로 인해 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 만들어진 미세유체 장치는 다공성 매질에서 생물막 발달을 연구하는 데 적합한 도구입니다. 미세유체공학은 물리적, 화학적 조건(예를 들어, 유체 흐름 및 영양소 농도)을 매우 정밀하게 제어하여 미생물 서식지의 환경을 모방할 수 있게 한다23. 또한, 미세유체 장치는 광학 현미경을 사용하여 마이크로미터 해상도로 쉽게 이미지화할 수 있고 온라인 측정(예: 국부 압력)과 결합할 수 있습니다.
이 작업에서 실험은 제어된 부과 흐름 조건에서 균일한 다공성 매질 아날로그에서 공극 크기의 영향을 연구하는 데 중점을 둡니다. 배양 배지의 흐름은 주사기 펌프를 사용하여 부과되며 미세 유체 채널을 통한 압력 차이는 압력 센서와 동시에 측정됩니다. 생물막 발달은 미세유체 채널에 Bacillus subtilis 의 플랑크톤 배양을 파종함으로써 시작됩니다. 진화하는 생물막의 정기적인 이미징 및 이미지 분석을 통해 다양한 실험 조건에서 표면 커버리지에 대한 공극 스케일 분해 정보를 얻을 수 있습니다. 압력 변화와 생물 막힘 정도에 대한 상관 정보는 생체 막힌 다공성 매체의 투과성 추정에 중요한 정보를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
압력 센서와 결합된 미세유체 다공성 배지 유사체는 다공성 배지에서 생물막 발달을 연구하는 데 적합한 도구를 제공합니다. 미세유체 다공성 매질 설계의 다양성, 특히 직경, 불규칙한 모양 및 기공 크기를 포함한 기둥의 배열은 많은 형상을 조사할 수 있게 해줍니다. 이러한 기하학적 구조는 단일 기공에서 다양한 자연(예: 토양) 및 산업용(예: 멤브레인 및 필터) 다공성 매체를 모방한 매우 복잡…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 SNSF PRIMA 보조금 179834(ES), ETH의 임의 자금 지원(RS), ETH 취리히 연구 보조금(RS 및 JMM), Eawag의 임의 자금 지원(JMM)을 인정합니다. 저자는 그림 1B 의 실험 설정을 설명해 준 Roberto Pioli와 실리콘 웨이퍼 준비에 대해 Ela Burmeister에게 감사를 표합니다.
Materials
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter, 1.2 µm Versapor Membrane | Pall Corporation | PN4190 | 1.2 µm filters |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to fill the channel with deionised water |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to have a stable temperature during the biofilm growth experiment | |
| Cell density meter CO8000 | WPA biowave | OD meter | |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| CorelCAD | CorelDRAW | software used to design the microfluidic channel geometries | |
| Culture tubes (14 mL, sterile) | greiner bio-one | Culture tubes | |
| Drying oven, VENTI-Line | VWR | Oven to cure the PDMS | |
| Handy | Migros | Detergent solution | |
| Hot plate with temperature control | VRW | to cure the PDMS-glass bonding after plasma treatment | |
| ImageJ | FIJI | Image analysis software | |
| Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick) | Eppendorf | Incubator | |
| Isopropanol (> 99.8%) | Sigma Aldrich | 67-63-0 | |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| Micro Slides, Plain, 75 x 60 mm | Corning | 2947-75X50 | Glass slides |
| Microfluidic pressure sensor (1 bar) | Elveflow | Pressure sensors | |
| Miltex Biopsy puncher, diameter 1.5 mm | Integra | Puncher to make the inlet and outlet holes of the microfluidic channel | |
| mrDev600 developer | Microresist | ||
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | Microscope | |
| Nutrient broth n°3 | Sigma Aldrich | ||
| Omnifix Syringe with Luer-Lock | B.Braun | syringes of different volume | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma bond the PDMS and the glass slide |
| Precision wipes (Kimtech Science) | Kimberly Clark | KCP-7552 | to dry the glass slide |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weigh the elastomer to crosslinking agent ratio |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N//Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Spincoater, Spin module SM150 | Sawatec | ||
| SU8 3050 Photoresist | Kayakuam | ||
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | Technic | |
| Tissue culture dish 150 | TPP | 93150 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | Sigma Aldrich | used to silanize the silicane wafer |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | Profilometer |
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