En mikrofluidisk plattform för att studera biotäppning i porösa medier
Summary
Detta protokoll beskriver en mikrofluidisk plattform för att studera biofilmutveckling i kvasi-2D porösa medier genom att kombinera högupplöst mikroskopiavbildning med samtidiga tryckskillnadsmätningar. Plattformen kvantifierar påverkan av porstorlek och vätskeflöden i porösa medier på bioigensättning.
Abstract
Bakteriella biofilmer finns i flera miljö- och industriella porösa medier, inklusive jord och filtreringsmembran. Biofilmer växer under vissa flödesförhållanden och kan täppa till porerna och därigenom omdirigera det lokala vätskeflödet. Biofilmens förmåga att täppa till porerna, den så kallade bioigensättningen, kan ha en enorm effekt på det porösa mediets lokala permeabilitet, vilket skapar en tryckuppbyggnad i systemet och påverkar massflödet genom det. För att förstå samspelet mellan biofilmtillväxt och vätskeflöde under olika fysikaliska förhållanden (t.ex. vid olika flödeshastigheter och porstorlekar) utvecklas i den aktuella studien en mikrofluidisk plattform för att visualisera biofilmutveckling med hjälp av ett mikroskop under externt påtvingade, kontrollerade fysiska förhållanden. Den biofilminducerade tryckuppbyggnaden i det porösa mediet kan mätas samtidigt med hjälp av trycksensorer och senare korreleras med biofilmens yttäckning. Den presenterade plattformen ger en baslinje för ett systematiskt tillvägagångssätt för att undersöka bioigensättning orsakad av biofilmer i porösa medier under flödesförhållanden och kan anpassas för att studera miljöisolat eller biofilmer med flera arter.
Introduction
Biofilmer – bakteriekolonier inbäddade i en självutsöndrad matris av extrapolymera ämnen (EPS) – är allestädes närvarande i naturliga porösa medier, såsom jord och akviferer1, och tekniska och medicinska tillämpningar, som bioremediering2, vattenfiltrering3 och medicintekniska produkter4. Biofilmmatrisen består av polysackarider, proteinfibrer och extracellulärt DNA5,6 och beror starkt på mikroorganismerna, tillgången på näringsämnen samt miljöförhållandena7. Ändå är matrisens funktioner universella; Det bildar ställningen i biofilmstrukturen, skyddar det mikrobiella samhället från mekaniska och kemiska påfrestningar och är till stor del ansvarig för biofilmernas reologiska egenskaper5.
I porösa medier kan tillväxten av biofilmer täppa till porerna, vilket orsakar den så kallade biotäppningen. Biofilmutvecklingen styrs av vätskeflödet och porstorleken, definierad som avståndet mellan två pelare, av det porösa mediet 8,9,10. Både porstorleken och vätskeflödet styr näringstransporten och de lokala skjuvkrafterna. I sin tur täpper den växande biofilmen porerna, vilket påverkar hastighetsfördelningen av vätskan 11,12,13, masstransporten och den hydrauliska ledningsförmågan hos det porösa mediet 14,15. Förändringarna i hydraulisk ledningsförmåga återspeglas genom ökat tryck i slutna system16,17,18,19. Nuvarande mikrofluidiska studier inom biofilmutveckling och bioigensättning fokuserar på att studera effekterna av flödeshastigheter i homogena geometrier16,20 (dvs med en singulär porstorlek) eller heterogena porösa medier12,21,22. För att särskilja effekterna av flödeshastigheter och porstorlek på biofilmutveckling och de resulterande tryckförändringarna i det biotäppta porösa mediet krävs en mycket kontrollerbar och mångsidig experimentell plattform som möjliggör studier av olika porösa mediegeometrier och miljöförhållanden parallellt.
Den aktuella studien introducerar en mikrofluidisk plattform som kombinerar tryckmätningar med samtidig avbildning av den framväxande biofilmen i det porösa mediet. På grund av dess gaspermeabilitet, biokompatibilitet och flexibilitet i kanalgeometridesignen är en mikrofluidisk anordning tillverkad av polydimetylsiloxan (PDMS) ett lämpligt verktyg för att studera biofilmutveckling i porösa medier. Mikrofluidik möjliggör kontroll av fysikaliska och kemiska förhållanden (t.ex. vätskeflöde och näringskoncentration) med hög precision för att efterlikna miljön i mikrobiella livsmiljöer23. Vidare kan mikrofluidiska enheter enkelt avbildas med mikrometrisk upplösning med hjälp av ett optiskt mikroskop och kombineras med onlinemätningar (t.ex. det lokala trycket).
I detta arbete fokuserar experimenten på att studera effekten av porstorlek i en homogen porös mediumanalog under kontrollerade pålagda flödesförhållanden. Flödet av ett odlingsmedium påförs med användning av en sprutpump, och tryckskillnaden genom den mikrofluidiska kanalen mäts samtidigt med trycksensorer. Biofilmutveckling initieras genom sådd av en planktonkultur av Bacillus subtilis i mikrofluidikkanalen. Regelbunden avbildning av den framväxande biofilmen och bildanalysen gör det möjligt att få porskaleupplöst information om yttäckningen under olika experimentella förhållanden. Den korrelerade informationen om tryckförändring och omfattningen av bioigensättning ger avgörande input för permeabilitetsuppskattningar av biotäppta porösa medier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikrofluidiska porösa medieanaloger i kombination med trycksensorer ger ett lämpligt verktyg för att studera biofilmutveckling i porösa medier. Mångsidigheten i utformningen av det mikrofluidiska porösa mediet, speciellt arrangemanget av pelarna, inklusive diameter, oregelbundna former och porstorlek, möjliggör undersökning av många geometrier. Dessa geometrier sträcker sig från enstaka porer till mycket komplexa, oregelbundet arrangerade hinder som efterliknar olika naturliga (t.ex. jordar) och industriella …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner stöd från SNSF PRIMA grant 179834 (till E.S.), diskretionär finansiering från ETH (till RS), ETH Zürich Research Grant (till R.S. och J.J.M.) och diskretionär finansiering från Eawag (till J.J.M.). Författarna vill tacka Roberto Pioli för att illustrera experimentuppställningen i figur 1B och Ela Burmeister för kiselskivans beredning.
Materials
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter, 1.2 µm Versapor Membrane | Pall Corporation | PN4190 | 1.2 µm filters |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to fill the channel with deionised water |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to have a stable temperature during the biofilm growth experiment | |
| Cell density meter CO8000 | WPA biowave | OD meter | |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| CorelCAD | CorelDRAW | software used to design the microfluidic channel geometries | |
| Culture tubes (14 mL, sterile) | greiner bio-one | Culture tubes | |
| Drying oven, VENTI-Line | VWR | Oven to cure the PDMS | |
| Handy | Migros | Detergent solution | |
| Hot plate with temperature control | VRW | to cure the PDMS-glass bonding after plasma treatment | |
| ImageJ | FIJI | Image analysis software | |
| Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick) | Eppendorf | Incubator | |
| Isopropanol (> 99.8%) | Sigma Aldrich | 67-63-0 | |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| Micro Slides, Plain, 75 x 60 mm | Corning | 2947-75X50 | Glass slides |
| Microfluidic pressure sensor (1 bar) | Elveflow | Pressure sensors | |
| Miltex Biopsy puncher, diameter 1.5 mm | Integra | Puncher to make the inlet and outlet holes of the microfluidic channel | |
| mrDev600 developer | Microresist | ||
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | Microscope | |
| Nutrient broth n°3 | Sigma Aldrich | ||
| Omnifix Syringe with Luer-Lock | B.Braun | syringes of different volume | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma bond the PDMS and the glass slide |
| Precision wipes (Kimtech Science) | Kimberly Clark | KCP-7552 | to dry the glass slide |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weigh the elastomer to crosslinking agent ratio |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N//Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Spincoater, Spin module SM150 | Sawatec | ||
| SU8 3050 Photoresist | Kayakuam | ||
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | Technic | |
| Tissue culture dish 150 | TPP | 93150 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | Sigma Aldrich | used to silanize the silicane wafer |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | Profilometer |
References
- Flemming, H. C., Wuertz, S. Bacteria and archaea on Earth and their abundance in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 17 (4), 247-260 (2019).
- Cunningham, A. B., Sharp, R. R., Hiebert, R., James, G. Subsurface biofilm barriers for the containment and remediation of contaminated groundwater. Bioremediation Journal. 7 (3-4), 151-164 (2003).
- Pronk, W., et al. Gravity-driven membrane filtration for water and wastewater treatment: A review. Water Research. 149, 553-565 (2019).
- Caldara, M., Belgiovine, C., Secchi, E., Rusconi, R. Environmental, microbiological, and immunological features of bacterial biofilms associated with implanted medical devices. Clinical Microbiology and Infection. 35 (2), 00221 (2022).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).
- Davey, M. E., O’Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (4), 847-867 (2000).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. Journal of Applied Microbiology. 85 (1), 19-28 (1998).
- Thomen, P., et al. Bacterial biofilm under flow: First a physical struggle to stay, then a matter of breathing. PLoS ONE. 12 (4), 0175197 (2017).
- Horn, H., Reiff, H., Morgenroth, E. Simulation of growth and detachment in biofilm systems under defined hydrodynamic conditions. Biotechnology and Bioengineering. 81 (5), 607-617 (2003).
- Thullner, M., Mauclaire, L., Schroth, M. H., Kinzelbach, W., Zeyer, J. Interaction between water flow and spatial distribution of microbial growth in a two-dimensional flow field in saturated porous media. Journal of Contaminant Hydrology. 58 (3-4), 169-189 (2002).
- Bottero, S., et al. Biofilm development and the dynamics of preferential flow paths in porous media. Biofouling. 29 (9), 1069-1086 (2013).
- Durham, W. M., Tranzer, O., Leombruni, A., Stocker, R. Division by fluid incision: Biofilm patch development in porous media. Physics of Fluids. 24 (9), 091107 (2012).
- Coyte, K. Z., Tabuteau, H., Gaffney, E. A., Foster, K. R., Durham, W. M. Microbial competition in porous environments can select against rapid biofilm growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (2), 161-170 (2017).
- Taylor, S. W., Jaffé, P. R. Biofilm growth and the related changes in the physical properties of a porous medium: 1. Experimental investigation. Water Resources Research. 26 (9), 2153-2159 (1990).
- Cunningham, A. B., Characklls, W. G., Abedeen, F., Crawford, D. Influence of biofilm accumulation on porous media hydrodynamics. Environmental Science and Technology. 25 (7), 1305-1311 (1991).
- Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. A web of streamers: Biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab on a Chip. 12 (24), 5133-5137 (2012).
- Biswas, I., Sadrzadeh, M., Kumar, A. Impact of bacterial streamers on biofouling of microfluidic filtration systems. Biomicrofluidics. 12 (4), 044116 (2018).
- Hassanpourfard, M., Ghosh, R., Thundat, T., Kumar, A. Dynamics of bacterial streamers induced clogging in microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (21), 4091-4096 (2016).
- Stewart, T. L., Scott Fogler, H. Pore-scale investigation of biomass plug development and propagation in porous media. Biotechnology and Bioengineering. 77 (5), 577-588 (2002).
- Hassanpourfard, M., Ghosh, R., Thundat, T., Kumar, A. Dynamics of bacterial streamers induced clogging in microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (21), 4091-4096 (2016).
- Aufrecht, J. A., et al. Pore-scale hydrodynamics influence the spatial evolution of bacterial biofilms in a microfluidic porous network. PLoS ONE. 14 (6), 0218316 (2019).
- Karimifard, S., Li, X., Elowsky, C., Li, Y. Modeling the impact of evolving biofilms on flow in porous media inside a microfluidic channel. Water Research. 188, 116536 (2021).
- Yawata, Y., Nguyen, J., Stocker, R., Rusconi, R. Microfluidic studies of biofilm formation in dynamic environments. Journal of Bacteriology. 198 (19), 2589-2595 (2016).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Ratkowsky, D. A., Olley, J., McMeekin, T. A., Ball, A. Relationship between temperature and growth rate of bacterial cultures. Journal of Bacteriology. 149 (1), 1-5 (1982).
- Ostvar, S., et al. Investigating the influence of flow rate on biofilm growth in three dimensions using microimaging. Advances in Water Resources. 117, 1-13 (2018).
- Carrel, M., et al. Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development. Water Research. 134, 280-291 (2018).
- Iglauer, S., Favretto, S., Spinelli, G., Schena, G., Blunt, M. J. X-ray tomography measurements of power-law cluster size distributions for the nonwetting phase in sandstones. Physical Review E. 82 (5), 10-12 (2010).
- Wu, C., Chu, J., Wu, S., Cheng, L., van Paassen, L. A. Microbially induced calcite precipitation along a circular flow channel under a constant flow condition. Acta Geotechnica. 14 (3), 673-683 (2019).
- Nassar, M. K., et al. Large-scale experiments in microbially induced calcite precipitation (MICP): reactive transport model development and prediction. Water Resources Research. 54 (1), 480-500 (2018).
- Jimenez-Martinez, J., Nguyen, J., Or, D. Controlling pore-scale processes to tame subsurface biomineralization. Reviews in Environmental Science and Biotechnology. 21 (1), 27-52 (2022).
