Uma plataforma microfluídica para o estudo do bioentupimento em meios porosos
Summary
O presente protocolo descreve uma plataforma microfluídica para estudar o desenvolvimento de biofilme em meios porosos quase-2D, combinando imagens de microscopia de alta resolução com medidas simultâneas de diferença de pressão. A plataforma quantifica a influência do tamanho dos poros e das taxas de fluxo de fluido em meios porosos no bioentupimento.
Abstract
Biofilmes bacterianos são encontrados em diversos meios porosos ambientais e industriais, incluindo solos e membranas de filtração. Os biofilmes crescem sob certas condições de fluxo e podem obstruir os poros, redirecionando assim o fluxo de fluido local. A capacidade dos biofilmes de obstruir os poros, o chamado bioentupimento, pode ter um tremendo efeito sobre a permeabilidade local do meio poroso, criando um acúmulo de pressão no sistema e impactando o fluxo de massa através dele. Para entender a interação entre o crescimento do biofilme e o fluxo de fluido sob diferentes condições físicas (por exemplo, em diferentes velocidades de fluxo e tamanhos de poros), no presente estudo, uma plataforma microfluídica é desenvolvida para visualizar o desenvolvimento do biofilme usando um microscópio sob condições físicas controladas e impostas externamente. O acúmulo de pressão induzido pelo biofilme no meio poroso pode ser medido simultaneamente com o uso de sensores de pressão e, posteriormente, correlacionado com a cobertura superficial do biofilme. A plataforma apresentada fornece uma linha de base para uma abordagem sistemática para investigar o bioentupimento causado por biofilmes em meios porosos sob condições de fluxo e pode ser adaptada para estudar isolados ambientais ou biofilmes multiespécies.
Introduction
Os biofilmes – colônias bacterianas embutidas em uma matriz autosecretada de substâncias extrapoliméricas (EPS) – são onipresentes em meios porosos naturais, como solos e aquíferos1, e aplicações técnicas e médicas, como biorremediação2, filtração de água3 e dispositivos médicos4. A matriz do biofilme é composta por polissacarídeos, fibras proteicas e DNA extracelular5,6 e depende fortemente dos microrganismos, da disponibilidade de nutrientes e das condições ambientais7. No entanto, as funções da matriz são universais; Forma o arcabouço da estrutura do biofilme, protege a comunidade microbiana de estresses mecânicos e químicos e é o grande responsável pelas propriedades reológicas dos biofilmes5.
Em meios porosos, o crescimento de biofilmes pode obstruir os poros, causando o chamado bioentupimento. O desenvolvimento do biofilme é controlado pelo fluxo de fluido e tamanho dos poros, definidos como a distância que separa dois pilares, do meio poroso 8,9,10. Tanto o tamanho dos poros quanto o fluxo de fluido controlam o transporte de nutrientes e as forças de cisalhamento locais. Por sua vez, o biofilme crescente obstrui os poros, afetando a distribuição de velocidade do fluido 11,12,13, o transporte de massa e a condutividade hidráulica do meio poroso 14,15. As mudanças na condutividade hidráulica são refletidas através do aumento da pressão em sistemas confinados16,17,18,19. Os estudos microfluídicos atuais em desenvolvimento de biofilme e bioentupimento concentram-se no estudo do impacto das velocidades de fluxo em geometrias homogêneas16,20 (isto é, com tamanho de poro singular) ou meios porosos heterogêneos12,21,22. No entanto, para desvendar os efeitos das vazões e do tamanho dos poros no desenvolvimento do biofilme e as consequentes mudanças de pressão no meio poroso bioentupido, é necessária uma plataforma experimental altamente controlável e versátil que permita o estudo de diferentes geometrias de meios porosos e condições ambientais em paralelo.
O presente estudo introduz uma plataforma microfluídica que combina medidas de pressão com imagens simultâneas do biofilme em evolução dentro do meio poroso. Devido à sua permeabilidade a gás, biocompatibilidade e flexibilidade no projeto da geometria do canal, um dispositivo microfluídico feito de polidimetilsiloxano (PDMS) é uma ferramenta adequada para estudar o desenvolvimento de biofilme em meios porosos. A microfluídica permite o controle das condições físicas e químicas (por exemplo, fluxo de fluidos e concentração de nutrientes) com alta precisão para mimetizar o ambiente de habitats microbianos23. Além disso, os dispositivos microfluídicos podem ser facilmente fotografados com resolução micrométrica usando um microscópio óptico e acoplados a medições on-line (por exemplo, a pressão local).
Neste trabalho, os experimentos se concentram em estudar o impacto do tamanho dos poros em um meio poroso homogêneo análogo sob condições controladas de escoamento imposto. O fluxo de um meio de cultura é imposto usando uma bomba de seringa, e a diferença de pressão através do canal microfluídico é medida simultaneamente com sensores de pressão. O desenvolvimento do biofilme é iniciado pela semeadura de uma cultura planctônica de Bacillus subtilis no canal microfluídico. Imagens regulares do biofilme em evolução e análise de imagens permitem obter informações resolvidas em escala de poros na cobertura da superfície sob várias condições experimentais. As informações correlacionadas da mudança de pressão e a extensão do bioentupimento fornecem subsídios cruciais para estimativas de permeabilidade de meios porosos bioentupidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Análogos de meios porosos microfluídicos acoplados a sensores de pressão fornecem uma ferramenta adequada para estudar o desenvolvimento de biofilme em meios porosos. A versatilidade no projeto do meio microfluídico poroso, especificamente na disposição dos pilares, incluindo diâmetro, formas irregulares e tamanho de poros, permite a investigação de muitas geometrias. Essas geometrias variam de poros simples a obstáculos altamente complexos e irregularmente dispostos que imitam diferentes meios porosos naturais…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem o apoio da 179834 de subvenção SNSF PRIMA (para E.S.), financiamento discricionário da ETH (para R.S.), ETH Zurich Research Grant (para R.S. e J.J.M.) e financiamento discricionário da Eawag (para J.J.M.). Os autores agradecem a Roberto Pioli pela ilustração do arranjo experimental na Figura 1B e Ela Burmeister pela preparação do wafer de silicone.
Materials
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter, 1.2 µm Versapor Membrane | Pall Corporation | PN4190 | 1.2 µm filters |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to fill the channel with deionised water |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to have a stable temperature during the biofilm growth experiment | |
| Cell density meter CO8000 | WPA biowave | OD meter | |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| CorelCAD | CorelDRAW | software used to design the microfluidic channel geometries | |
| Culture tubes (14 mL, sterile) | greiner bio-one | Culture tubes | |
| Drying oven, VENTI-Line | VWR | Oven to cure the PDMS | |
| Handy | Migros | Detergent solution | |
| Hot plate with temperature control | VRW | to cure the PDMS-glass bonding after plasma treatment | |
| ImageJ | FIJI | Image analysis software | |
| Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick) | Eppendorf | Incubator | |
| Isopropanol (> 99.8%) | Sigma Aldrich | 67-63-0 | |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| Micro Slides, Plain, 75 x 60 mm | Corning | 2947-75X50 | Glass slides |
| Microfluidic pressure sensor (1 bar) | Elveflow | Pressure sensors | |
| Miltex Biopsy puncher, diameter 1.5 mm | Integra | Puncher to make the inlet and outlet holes of the microfluidic channel | |
| mrDev600 developer | Microresist | ||
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | Microscope | |
| Nutrient broth n°3 | Sigma Aldrich | ||
| Omnifix Syringe with Luer-Lock | B.Braun | syringes of different volume | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma bond the PDMS and the glass slide |
| Precision wipes (Kimtech Science) | Kimberly Clark | KCP-7552 | to dry the glass slide |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weigh the elastomer to crosslinking agent ratio |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N//Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Spincoater, Spin module SM150 | Sawatec | ||
| SU8 3050 Photoresist | Kayakuam | ||
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | Technic | |
| Tissue culture dish 150 | TPP | 93150 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | Sigma Aldrich | used to silanize the silicane wafer |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | Profilometer |
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