ओस्टियोक्लास्ट शरीर में प्रमुख हड्डी-पुनर्जीवित कोशिकाएं हैं। यह प्रोटोकॉल मानव परिधीय रक्त मोनोसाइट्स से ओस्टियोक्लास्ट के इन विट्रो भेदभाव के लिए एक विश्वसनीय विधि का वर्णन करता है। इस विधि का उपयोग होमोस्टेसिस और रोगों में ओस्टियोक्लास्ट जीव विज्ञान को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में किया जा सकता है।
ओस्टियोक्लास्ट (ओसी) हड्डी-पुनर्जीवित कोशिकाएं हैं जो कंकाल के विकास और वयस्क हड्डी रीमॉडेलिंग में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। कई हड्डी विकार ओसी के बढ़ते भेदभाव और सक्रियण के कारण होते हैं, इसलिए इस पैथोबायोलॉजी का निषेध एक महत्वपूर्ण चिकित्सीय सिद्धांत है। दो प्रमुख कारक माइलॉयड अग्रदूतों से ओसी के भेदभाव को चलाते हैं: मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) और परमाणु कारक कप्पा-बी लिगैंड (रैंकएल) के रिसेप्टर एक्टिवेटर। मानव परिसंचारी सीडी 14 + मोनोसाइट्स को लंबे समय से इन विट्रो में ओसी में अंतर करने के लिए जाना जाता है। हालांकि, एक्सपोजर समय और रैंकएल की एकाग्रता भेदभाव दक्षता को प्रभावित करती है। दरअसल, विट्रो में मानव ओसी की पीढ़ी के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, लेकिन वे अक्सर एक खराब और लंबी भेदभाव प्रक्रिया में परिणाम देते हैं। इसमें, समय पर तरीके से कार्यात्मक रूप से सक्रिय परिपक्व मानव ओसी उत्पन्न करने के लिए एक मजबूत और मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है। सीडी 14+ मोनोसाइट्स मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से समृद्ध होते हैं और रैंक को विनियमित करने के लिए एम-सीएसएफ के साथ प्राइम किए जाते हैं। रैंकएल के बाद के संपर्क में आने से खुराक और समय-निर्भर तरीके से ओसी उत्पन्न होते हैं। ओसीएस की पहचान टार्टरेट एसिड-प्रतिरोधी फॉस्फेट (टीआरएपी) और प्रकाश माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के साथ धुंधला करके की जाती है। कार्यात्मक रूप से सक्रिय ओसी की पहचान करने के लिए नाभिक और एफ-एक्टिन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने का उपयोग किया जाता है। इसके अलावा, OSCAR + CD14− परिपक्व OCs को फ्लो साइटोमेट्री सेल सॉर्टिंग के माध्यम से और अधिक समृद्ध किया जाता है, और OC कार्यक्षमता खनिज (या डेंटिन / हड्डी) पुनर्जीवन परख और एक्टिन रिंग गठन द्वारा निर्धारित की जाती है। अंत में, एक ज्ञात ओसी अवरोधक, रोटेनोन, परिपक्व ओसी पर उपयोग किया जाता है, यह दर्शाता है कि एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) उत्पादन एक्टिन रिंग अखंडता और ओसी फ़ंक्शन के लिए आवश्यक है। अंत में, इस काम में उच्च संख्या में ओसी को अलग करने के लिए एक मजबूत परख स्थापित की गई है, जो एक्टिन रिंग स्टेनिंग और एटीपी परख के साथ संयोजन में ओसी फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने और नए चिकित्सीय यौगिकों की जांच करने के लिए एक उपयोगी इन विट्रो मॉडल प्रदान करता है जो भेदभाव प्रक्रिया को संशोधित कर सकते हैं।
ओस्टियोक्लास्ट (ओसी) हेमटोपोइएटिक वंश की बहुराष्ट्रीय विशाल कोशिकाएं हैं जिनमें हड्डी को पुनर्जीवित करने की अनूठी क्षमता होती है। वे कंकाल 1,2 के विकास और निरंतर रीमॉडेलिंग के लिए जिम्मेदार हैं। विकास के कंकाल चरणों में, ओसी और ऊतक-निवासी मैक्रोफेज एरिथ्रो-माइलॉयड पूर्वजों से प्राप्त होते हैं और हड्डी के आला और अंग ऊतकों को उपनिवेशित करते हैं। शारीरिक स्थितियों में, एरिथ्रो-माइलॉयड पूर्वजों को सामान्य हड्डी के विकास और दांत विस्फोट के लिए आवश्यक होता है, जबकि अस्थि आला में परिसंचारी रक्त मोनोसाइट्स का प्रवाह ओसी, हड्डी द्रव्यमान और अस्थि मज्जा गुहा3 के प्रसवोत्तर रखरखाव प्रदान करता है। पैथोलॉजिकल स्थितियों के तहत, मोनोसाइट्स को सक्रिय सूजन की साइटों पर भर्ती किया जाता है और पैथोलॉजिकल हड्डी विनाश में योगदान कर सकता है 4,5.
गठिया के कई रूपों वाले रोगी संयुक्त सूजन का अनुभव करते हैं, जिससे ओसी6 के कारण प्रगतिशील संयुक्त विनाश होता है। उदाहरण के लिए, रुमेटीइड गठिया (आरए) में, अतिसक्रिय ओसी पैथोलॉजिकल हड्डी के क्षरण और संयुक्त विनाश7,8 के लिए जिम्मेदार हैं, और वर्तमान उपचार अक्सर हड्डी की क्षति में सुधार या रोक नहीं देते हैं 9,10,11. आरए रोगियों12,13,14 में जनसंख्या वितरण और ट्रांसक्रिप्टोमिक और एपिजेनेटिक हस्ताक्षर दोनों के संदर्भ में मोनोसाइट्स को प्रसारित करने में परिवर्तन की सूचना दी गई है। इसके अलावा, यह बताया गया है कि भड़काऊ उत्तेजना के लिए परिवर्तित मोनोसाइट प्रतिक्रियाएं सक्रिय रोग15,16,17 के साथ आरए रोगियों में ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस को प्रभावित करती हैं।
ओसी का भेदभाव एक जटिल मल्टीस्टेप प्रक्रिया है जिसमें ओसी अग्रदूतों में भेदभाव के लिए माइलॉयड अग्रदूत कोशिकाओं की प्रतिबद्धता शामिल है। ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस के दौरान, ओसी सेल-सेल संलयन, अपूर्ण साइटोकिनेसिस और एक परमाणु रीसाइक्लिंग प्रक्रिया के माध्यम से विशाल और बहुउद्देशीय हो जाते हैं जिसे विखंडन और संलयन 18,19,20 के रूप में वर्णित किया गया है। विट्रो में ओसी को अलग करने की क्षमता ने हड्डी जीव विज्ञान की समझ में महत्वपूर्ण प्रगति की अनुमति दीहै। मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) और परमाणु कारक कप्पा-बी लिगैंड (रैंकएल) के रिसेप्टर एक्टिवेटर के संपर्क में आने पर ओसी अग्रदूतों से अलग होते हैं। उत्तरार्द्ध विट्रो और विवो में ओसी के सामान्य विकास और कार्य के लिए आवश्यक है, यहां तक किभड़काऊ स्थितियों 6,22,23 के तहत भी। रैंकएल ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोसाइट्स द्वारा प्रस्तुत किया जाता है, साथ ही सक्रिय टी कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट ्स द्वारा सूजन आरए सिनोवियम 2,24,25 में प्रस्तुत किया जाता है। ओसी भेदभाव प्रक्रिया के दौरान, एम-सीएसएफ के संपर्क में आने वाले मोनोसाइट्स अपने कोशिका झिल्ली पर परमाणु कारक कप्पा-बी (रैंक) अभिव्यक्ति के रिसेप्टर एक्टिवेटर को विनियमित करते हैं और रैंकएल के साथ बाद की उत्तेजना के तहत, टार्टरेट-प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (टीआरएपी) -पॉजिटिव मोनोन्यूक्लियर प्री-ओसी और फिर मल्टीन्यूक्लियेटेड ओसी15,26 में अंतर करते हैं। ओसी कई एंजाइमों का उत्पादन करते हैं, उनमें से प्रमुख ट्रैप है, जो हड्डी27 के भीतर फॉस्फोप्रोटीन के क्षरण को सक्षम बनाता है। ओसी भेदभाव का एक नियामक और मार्कर ओसी-संबद्ध रिसेप्टर (ऑस्कर) है। यह ओसी वंश28 के लिए प्रतिबद्ध अग्रदूत कोशिकाओं में जल्दी से विनियमित होता है। परिपक्व विशाल काय बहुराष्ट्रीय ओसी एक बड़े सीलिंग ज़ोन को उत्पन्न करके कंकाल मैट्रिक्स को नीचा (पुनर्जीवित) कर सकते हैं, जो 21,29,30 की एक अशांत सीमा के आसपास एक एक्टिन रिंग से बना है। ओसी की हड्डी पुनर्जीवन क्षमता के लिए साइटोस्केलेटन पुनर्गठन और परिणामस्वरूप ध्रुवीकरण और एक जटिल झिल्ली के गठन की आवश्यकता होती है, जो तथाकथित उबड़-खाबड़ सीमा है। उबड़-खाबड़ सीमा एक एफ-एक्टिन-समृद्ध संरचना के एक बड़े गोलाकार बैंड से घिरी हुई है, जो एक्टिन रिंग या सीलिंग ज़ोन है। इन विट्रो और विवो दोनों में हड्डी को पुनर्जीवित करने के लिए ओसी के लिए एक्टिन रिंग अखंडता आवश्यक है, और दोषपूर्ण रफल्ड बॉर्डर गठन कम वैक्यूलर एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (वी-एटीपीस) अभिव्यक्ति 31,32,33 से जुड़ा हुआ है। इसके अलावा, ओसी माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध कोशिकाएं हैं, और एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी)31,32,33 की अशांत सीमा पर स्थानीयकृत ओसी में माइटोकॉन्ड्रियल जैसी संरचनाओं के साथ जुड़ता है। रोटेनोन माइटोकॉन्ड्रियल कॉम्प्लेक्स आई के एक मजबूत अवरोधक के रूप में कार्य करता है और एटीपी उत्पादन को प्रभावित करता है। रोटेनोन को ओसी भेदभाव और फ़ंक्शन34 को बाधित करने के लिए भी दिखाया गया है।
यह प्रोटोकॉल मानव परिधीय रक्त नमूनों से इन विट्रो ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस की एक कुशल और अनुकूलित विधि का वर्णन करता है। मानव परिधीय रक्त में, सीडी 14 + मोनोसाइट्स ओसी 15,35,36 का मुख्य स्रोत हैं। इस प्रोटोकॉल में, एक्सपोजर के कैनेटीक्स और एम-सीएसएफ और रैंकएल की सांद्रता को इष्टतम ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस के लिए समायोजित किया गया है। मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को पहले घनत्व ढाल द्वारा पूरे रक्त में मौजूद एरिथ्रोसाइट्स और ग्रैनुलोसाइट्स से अलग किया जाता है; फिर उन्हें चुंबकीय मोतियों द्वारा सकारात्मक चयन का उपयोग करके सीडी 14 + मोनोसाइट्स के लिए समृद्ध किया जाता है। पृथक सीडी 14+ मोनोसाइट्स को फिर एम-सीएसएफ के साथ रात भर इनक्यूबेट किया जाता है। यह मोनोसाइट्स को रैंक15,26 की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए प्रेरित करता है। रैंकएल का बाद का जोड़ ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस और मल्टीन्यूक्लियेशन को समय-निर्भर तरीके से प्रेरित करता है। सक्रिय-पुनर्जीवित ओसी कोशिका झिल्ली30,32 के किनारे पर एफ-एक्टिन रिंग्स का विशिष्ट वितरण दिखाते हैं और ट्रैप के लिए धुंधला हो जाते हैं। परिपक्व ओसी का विश्लेषण ट्रैप + मल्टीन्यूक्लियेटेड (तीन से अधिक नाभिक) कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करके किया जाता है। परिपक्व ओसी की कार्यात्मक क्षमता का मूल्यांकन उनके पुनरुत्थान, एक्टिन रिंग अखंडता और एटीपी उत्पादन द्वारा किया जा सकता है। इसके अलावा, विभेदित सीडी 14 − ऑस्कर + ओसी को समृद्ध किया जा सकता है और खनिज (या डेंटिन) पुनरुत्थान और एफ-एक्टिन संगठन के माध्यम से ओसी कार्यक्षमता पर कुछ यौगिकों के प्रभावों का आकलन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इस काम में, एक ज्ञात ओसी अवरोधक, रोटेनोन, का उपयोग एक यौगिक के उदाहरण के रूप में किया जाता है जो ओसी की कार्यक्षमता को प्रभावित करता है। रोटेनोन के तहत कम ओसी पुनर्जीवन गतिविधि कम एटीपी उत्पादन और एक्टिन रिंग विखंडन से जुड़ी है। अंत में, यह प्रोटोकॉल एक मजबूत परख स्थापित करता है जिसका उपयोग इन विट्रो में ओसी भेदभाव और कार्य के कई जैविक पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक संदर्भ विधि के रूप में किया जा सकता है।
इस पद्धति का उपयोग (1) स्वास्थ्य और रोगों में ओसी में अंतर करने के लिए मोनोसाइट्स को प्रसारित करने की क्षमता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, साथ ही (2) ओसी भेदभाव और कार्य पर चिकित्सीय उम्मीदवारों का प्रभाव। यह मजबूत ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस प्रोटोकॉल अग्रदूत कोशिकाओं से ओसी भेदभाव और परिपक्व ओसी के कार्य दोनों पर हड्डी-लक्षित उपचारों की प्रभावकारिता और तंत्र के निर्धारण को सक्षम बनाता है।
इन विट्रो में बड़ी संख्या में कार्यात्मक ओसी की आसान संस्कृति और अलगाव हड्डी जीव विज्ञान और ओसी-मध्यस्थता रोगों की समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण हैं। शास्त्रीय रूप से, ओसी ओस्टियोब्लास्ट या स्ट्रोमल कोशिकाओं और प्लीहा या अस्थि मज्जा38,39 से हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृतियों में उत्पन्न हुए थे। ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस की समझ में एक महत्वपूर्ण सफलता ओसी गठन, भेदभाव और अस्तित्वके प्रमुख नियामक के रूप में रैंकएल की पहचान थी। रैंकएल-निर्भर संस्कृति प्रणालियों के प्रारंभिक प्रोटोकॉल ने ओसी उत्पादन 21,41,42 के लिए पीबीएमसी का उपयोग किया। हालांकि, ये मिश्रित संस्कृतियां लंबी हैं और कई भ्रामक कारक पेश करती हैं जो ओसी भेदभाव और कार्य पर प्रत्यक्ष प्रभाव ों का परीक्षण करने की क्षमता को सीमित करती हैं। यह प्रोटोकॉल मानव परिधीय सीडी 14 + मोनोसाइट्स से ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस के एक कुशल और विश्वसनीय इन विट्रो मॉडल का वर्णन करता है जिसमें इष्टतम ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस 7 दिनों के भीतर प्राप्त किया जा सकता है (चित्रा 1 और चित्रा 2), जो कुछ अन्य प्रोटोकॉल43,44,45,46 की तुलना में काफी तेज है।. इस प्रोटोकॉल की मुख्य विशिष्ट विशेषताएं हैं (1) शुद्ध सीडी 14 + मोनोसाइट्स का उपयोग, (2) रैंकएल के संपर्क में आने से पहले एम-सीएसएफ के साथ मोनोसाइट्स की प्राइमिंग, (3) संस्कृति की लंबाई (<7 दिन), और (4) ओसी गठन (ट्रैप स्टेनिंग) और इनहिबिटर के साथ फ़ंक्शन (पुनरुत्थान, एटीपी उत्पादन, एक्टिन रिंग पुनर्गठन) के निषेध का विश्वसनीय पता लगाना।
कार्यप्रणाली के अनुकूलन के दौरान, कई महत्वपूर्ण बिंदुओं की पहचान की गई थी। यह देखा गया है कि ओसी का इन विट्रो भेदभाव काफी हद तक सीडी 14+ मोनोसाइट्स के सीडिंग घनत्व पर निर्भर है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं को उच्च घनत्व (96-वेल प्लेट के 1 x 105 कोशिकाओं / कुएं में, 100 μL माध्यम में) पर बीज दिया जाता है, क्योंकि कोशिकाओं के लिए एक-दूसरे के साथ बातचीत करने में सक्षम होना और फ्यूज होने और परिपक्व ओसी बनने के लिए आवश्यक है। इसी तरह, बहुत अधिक घनत्व पर कोशिकाओं को सीडिंग करना मध्यम सीमाओं और आवश्यक स्थान की कमी के कारण उनके भेदभाव और विकास को सीमित करता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल के साथ अधिकतम सफलता प्राप्त करने के लिए, घनत्व ढाल पृथक्करण को ध्यान से करना और यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि सीडी 14 + कोशिकाओं की समृद्ध आबादी यथासंभव शुद्ध है। उदाहरण के लिए, अपर्याप्त धोने के चरणों के परिणामस्वरूप प्लेटलेट्स को हटाने की कमी होती है, जिसके परिणामस्वरूप ओसी भेदभाव47,48 को रोकता है। इसी तरह, अकेले एम-सीएसएफ के साथ उत्तेजित पृथक सीडी 14 + तैयारी में मामूली टी सेल संदूषण की उपस्थिति के परिणामस्वरूप ओसी भेदभाव हो सकता है, संभवतः टी कोशिकाओंद्वारा रैंकएल स्राव के माध्यम से। इसलिए, प्रत्येक प्रयोग के लिए एम-सीएसएफ नियंत्रण को शामिल करना महत्वपूर्ण है। नमूने की शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए एक नियमित शुद्धता जांच, विशेष रूप से एक नई आइसोलेशन किट का उपयोग करते समय, की भी सिफारिश की जाती है।
इष्टतम ओसी संख्या (सीमा: ~ 200-1,600 ओसी / वेल) न्यूक्लियोसाइड और एल-ग्लूटामाइन से समृद्ध α-एमईएम माध्यम का उपयोग करके प्राप्त की जाती है। डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) और रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) 1640 माध्यम सहित अन्य पारंपरिक संस्कृति मीडिया, ओसी उपज को प्रभावित करते हैं। एफबीएस का स्रोत ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस को भी प्रभावित कर सकता है। एफबीएस के विभिन्न बैचों से रैंक-एल-व्युत्पन्न ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस कम हो सकता है, साथ ही एम-सीएसएफ नियंत्रणों में ट्रैप + बहुराष्ट्रीय कोशिकाओं की कम संख्या की उपस्थिति हो सकती है (पूरक चित्रा 3)। इसलिए, लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए, यह सलाह दी जाती है कि उपयोग से पहले नए एफबीएस बैचों का परीक्षण करें और भेदभाव प्रक्रिया में भिन्नता को कम करने के लिए प्रयोगों के दौरान एक ही बैच के साथ जारी रखें। इसके अतिरिक्त, दाता-से-दाता परिवर्तनशीलता, अंत समय बिंदु पर प्राप्त विभेदित ओसी की कुल संख्या के संदर्भ में, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय एक सीमा का गठन करती है, उदाहरण के लिए, रोगियों के लिए स्वस्थ दाताओं की तुलना करने के लिए। इन मामलों में, बिल्कुल एक ही स्थिति और मध्यम, एफबीएस और अन्य अभिकर्मकों के समान लॉट का उपयोग करना अनिवार्य है।
इष्टतम ओसी भेदभाव और परिपक्वता के लिए एक और आवश्यक कदम रैंकएल जोड़ से पहले एम-सीएसएफ के साथ मोनोसाइट्स को भड़काना है। रैंकएल से 18-24 घंटे पहले एम-सीएसएफ के लिए कोशिकाओं के संपर्क में आने से मोनोसाइट्स को रैंकअभिव्यक्ति 15,26 को विनियमित करने में मदद मिलती है। इस समय रैंकएल को जोड़ने से खुराक-निर्भर तरीके से इष्टतम ओसी भेदभाव सुनिश्चित होता है। ओसी भेदभाव की डिग्री दाता से दाता में भिन्न होती है; हालांकि, 25 एनजी / एमएल रैंकएल आमतौर पर अधिकांश दाताओं में ओसी की उच्च संख्या को अलग करने के लिए पर्याप्त है। इसके अतिरिक्त, यौगिकों की प्रारंभिक स्क्रीनिंग के लिए परख में 25 एनजी / एमएल रैंकएल का उपयोग किया जा सकता है, क्योंकि यह परीक्षण यौगिकों के बढ़ाने और निरोधात्मक प्रभाव दोनों के मूल्यांकन की सुविधा प्रदान करता है। अन्य संस्कृति प्रणालियों ने रैंकएल जोड़ने से पहले इनक्यूबेशन समय पहले एम-सीएसएफ का उपयोग किया है, लेकिन इसके परिणामस्वरूप ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस50 के लिए लंबे समय तक संवर्धन समय होता है। इसके अलावा, प्राइमेड मोनोसाइट्स को रात भर इनक्यूबेट करने के लिए छोड़ने से उन्हें प्लेट से जुड़ने की अनुमति मिलती है, हालांकि पूरी तरह से अनुयायी अवस्था में नहीं। इसलिए, जब रैंकएल को पहली बार पेश किया जाता है, तो प्राइमेड मोनोसाइट्स की टुकड़ी और हानि को रोकने के लिए माध्यम को पूरी तरह से बदलने के बजाय बहुत सावधानी से बदलना चाहिए। मध्यम कमी से बचने और कोशिका मृत्यु को रोकने के लिए माध्यम को हर 3-4 दिनों में ताज़ा करने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, इस परख में उपयोग की जाने वाली कम मात्रा (96-वेल प्लेट में 100 μL / well) के कारण, खाली कुओं का एक फ्रेम होना अत्यंत महत्वपूर्ण है जो परख कुओं के चारों ओर एक जलीय घोल (यानी, बाँझ आसुत एच2ओ या पीबीएस) से भरे होते हैं। यह मध्यम वाष्पीकरण और किनारे के प्रभाव को रोकता है।
अंत में, चयापचय परख (जैसे, एटीपी परख) के लिए, यह जरूरी है कि कोशिकाएं प्रतिकृति के बीच विशाल मानक विचलन से बचने के लिए व्यवहार्य हों (चित्रा 5)। कोशिकाओं की उच्च व्यवहार्यता कोशिकाओं को छांटने और क्रमबद्ध ओसी के आगे संवर्धन के लिए भी महत्वपूर्ण है (चित्रा 4)। हालांकि, इस विधि की कई सीमाएं हैं। पूरी तरह से परिपक्व ओसी बहुत अनुयायी हैं और प्लेटों से अलग करना मुश्किल है। बड़े ओसी को अलग करना अक्सर असंभव होता है, जिससे कम सेल उपज हो सकती है। इसलिए, कोशिकाओं को छंटाई के बाद और आवश्यक एकाग्रता पर चढ़ाना शुरू करने से पहले गिना जाना चाहिए। इसके अलावा, वर्तमान प्रोटोकॉल में, प्रवाह साइटोमेट्री के लिए डाउनस्ट्रीम सतह धुंधला होने में झिल्ली परिवर्तन को रोकने के लिए ओसी को अलग करने के लिए एक गैर-एंजाइमेटिक विधि (एक्यूटेज) का उपयोग किया जाता है। सेल स्क्रैपर्स (नरम या कठोर अंत दोनों के साथ) के उपयोग का भी परीक्षण किया गया था और उच्च कोशिका मृत्यु का कारण बना। ईडीटीए समाधानों का उपयोग करके एंजाइमेटिक डिटेचमेंट का उपयोग अलग ओसी की उच्च उपज के लिए किया जा सकता है जब डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए झिल्ली अखंडता की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अतिरिक्त, ओसी को एक साथ जुड़ने से रोकने के लिए, सेल डिटेचमेंट के बाद सभी बफर में ईडीटीए की उच्च सांद्रता का उपयोग, साथ ही फ्लो साइटोमेट्री अधिग्रहण से पहले उचित फ़िल्टरिंग की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ओसी संस्कृतियां परिपक्व ओसी, ओसी अग्रदूतों और मैक्रोफेज से युक्त कोशिकाओं की एक विषम आबादी हैं। मैक्रोफेज को आसानी से ओसी से अलग किया जा सकता है, हालांकि मोनोन्यूक्लियर प्री-ओसी और मल्टीन्यूक्लियर ओसी दोनों ऑस्कर व्यक्त करते हैं और वर्तमान विधि के साथ अलग नहीं किए जा सकते हैं (चित्रा 4)। दरअसल, यह उत्तरार्द्ध मुद्दा इस पद्धति की मुख्य सीमा का गठन करता है। इसके अलावा, ओएससीएआर की कम अभिव्यक्ति एम-सीएसएफ संस्कृतियों (चित्रा 4 बी) में भी मौजूद है और मैक्रोफेज को इंगित कर सकती है जो ओसी वंश प्रतिबद्धता के लिए प्रमुख हैं। एफएमओ धुंधला संकेत के आधार पर ऑस्कर + कोशिकाओं के लिए गेट सेट करना महत्वपूर्ण है, जैसा कि चित्रा 4 बी में दिखाया गया है।
सारांश में, यह प्रोटोकॉल प्राथमिक मानव मोनोसाइट्स को प्रसारित करने से सक्रिय और कार्यात्मक रूप से परिपक्व ओसी के कुशल उत्पादन के लिए एक अनुकूलित और मजबूत विधि का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल की ताकत कम समय अवधि में ओसी उत्पन्न करने और उच्च संख्या में विभेदित ओसी उत्पन्न करने की क्षमता है। यह विधि ओसी भेदभाव और कार्य को अंतर्निहित बुनियादी तंत्र की जांच के लिए रास्ता खोलती है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक इस काम में उनके समर्थन और सहायता के लिए स्कूल ऑफ इंफेक्शन एंड इम्युनिटी के भीतर फ्लो कोर सुविधा और ग्लासगो इमेजिंग सुविधा (जीआईएफ) को कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार करते हैं।
µ-Slide 18 well chamber slides | ibidi | 81816 | |
8-well glass chamber slides | Ibidi | 80807 | |
96-well TC plate | Corning | 3596 | |
96-well osteo assay stripwell plate | Corning | 3989 | |
Acetate solution | Sigma Aldrich | 386-3 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Acetone | VWR | 20066.330 | |
Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit | SIGMA-ALDRICH | 387A-1KT | |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Theremo Fisher – Invitrogen | A12379 | AF488 |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher – Invitrogen | A22287 | AF647 |
Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose | Fisher Scientific | 11321867 | 2DG, 98% |
Alpha minimum essential medium | gibco | 22571-020 | |
ATPlite 1step | PerkinElmer | 6016731 | Luminiscence ATP detection assay system |
BD FACSAria III cell sorter | BD Biosciences | ||
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom | Greiner bio-one | 655083 | White-bottom plates |
Citrate solution | Sigma Aldrich | 91-5 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes | Fisher Scientific | 352054 | |
Corning osteo assay surface multiple well plate | Sigma-Aldrich | CLS3989 | |
Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell | Corning | CLS3989-2EA | |
DAPI | Theremo Fisher | D3571 | |
EasySep human CD14 positive selection kit | STEMCELL Technologies | 17858 | |
EasySep red blood cell lysis buffer (10x) | StemCell Technologies | 20110 | |
eBioscience fixable viability dye eFluor 780 | Theremo Fisher – Invitrogen | 65-0865-14 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E7889-100ML | |
EVOS FL auto imaging system | Thermo Fisher | A32678 | |
Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap | Fisher Scientific | 10314791 | |
Falcon tubes 15 mL | Corning | 430790 | |
Falcon tubes 50 mL | Corning | 430828 | |
Fast Garnet GBC base solution | Sigma Aldrich | 387-2 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Fetal bovine serum | gibco | 10500-064 | FBS |
Ficoll-Paque Plus | cytiva | 17144003 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F-8775 | |
Human sRANK ligand | PEPROTECH | 310-01-100UG | Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL) |
ImageJ Image analysis software | Image J | version 2.9.0 | |
L-glutamine | gibco | 25030-024 | |
Lithium heparin tubes (9 mL) | VACUETTE | 455084 | |
Macrophage colony-stimulating factor | PEPROTECH | 300-25-100UG | M-CSF |
Napthol AS-BI phosphoric acid solution | Sigma Aldrich | 387-1 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Neubauer hemacytometer counting chamber | Camlab | SKU 1127885 | |
Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes | Sigma-Aldrich | Q4876-5MG | |
OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit | Miltenyi Biotec | 130-107-661 and 130-107-617 | Clone REA494 |
PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody | Biolegend | 325618 | Clone HCD14 |
Penicilin/streptomycin | SIGMA | P0781 | |
PHERAstar machine and software | BMG LABTECH | ||
Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x) | gibco | 14190-094 | |
REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-443 | |
Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044-1L | |
Sodium nitrite solution | Sigma Aldrich | 91-4 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Tartrate solution | Sigma Aldrich | 387-3 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML |