Osteoklaster är viktiga benresorberande celler i kroppen. Detta protokoll beskriver en tillförlitlig metod för in vitro-differentiering av osteoklaster från humana perifera blodmonocyter. Denna metod kan användas som ett viktigt verktyg för att ytterligare förstå osteoklastbiologi vid homeostas och vid sjukdomar.
Osteoklaster (OC) är benresorberande celler som spelar en avgörande roll i skelettutveckling och ombyggnad av vuxna ben. Flera bensjukdomar orsakas av ökad differentiering och aktivering av OC, så hämningen av denna patobiologi är en viktig terapeutisk princip. Två nyckelfaktorer driver differentieringen av OC från myeloida prekursorer: makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF) och receptoraktivator av kärnfaktor kappa-B-ligand (RANKL). Humana cirkulerande CD14 + -monocyter har länge varit kända för att differentiera till OC in vitro. Exponeringstiden och koncentrationen av RANKL påverkar dock differentieringseffektiviteten. Faktum är att protokoll för generering av humana OCs in vitro har beskrivits, men de resulterar ofta i en dålig och långvarig differentieringsprocess. Häri tillhandahålls ett robust och standardiserat protokoll för att generera funktionellt aktiva mogna mänskliga OCs i tid. CD14 + monocyter anrikas från humana mononukleära celler i perifert blod (PBMC) och grundas med M-CSF för att uppreglera RANK. Efterföljande exponering för RANKL genererar OC på ett dos- och tidsberoende sätt. OCs identifieras och kvantifieras genom färgning med tartrat syrabeständigt fosfatas (TRAP) och ljusmikroskopianalys. Immunofluorescensfärgning av kärnor och F-aktin används för att identifiera funktionellt aktiva OC. Dessutom anrikas OSCAR+CD14− mogna OCs ytterligare via flödescytometricellsortering och OC-funktionalitet kvantifierad genom mineralresorptionsanalyser (eller dentin/ben) och aktinringbildning. Slutligen används en känd OC-hämmare, rotenon, på mogna OCs, vilket visar att adenosintrifosfat (ATP) produktion är avgörande för aktinringintegritet och OC-funktion. Sammanfattningsvis etableras en robust analys för differentiering av ett stort antal OCs i detta arbete, vilket i kombination med aktinringsfärgning och en ATP-analys ger en användbar in vitro-modell för att utvärdera OC-funktion och för att screena för nya terapeutiska föreningar som kan modulera differentieringsprocessen.
Osteoklaster (OC) är flerkärniga jätteceller av hematopoetisk härstamning med en unik förmåga att resorbera ben. De ansvarar för utveckling och kontinuerlig ombyggnad av skelettet 1,2. I skelettfaserna av utveckling härrör OC och vävnadsbosatta makrofager från erytro-myeloida föregångare och koloniserar bennischen och organvävnaderna. Under fysiologiska förhållanden krävs erytro-myeloida föregångare för normal benutveckling och tandutbrott, medan tillströmningen av cirkulerande blodmonocyter i bennischen ger postnatalt underhåll av OC, benmassa och benmärgshålighet3. Under patologiska förhållanden rekryteras monocyter till platser med aktiv inflammation och kan bidra till patologisk benförstöring 4,5.
Patienter med flera former av artrit upplever ledinflammation, vilket leder till progressiv ledförstörelse orsakad av OC6. Till exempel, vid reumatoid artrit (RA), är överaktiverade OC ansvariga för patologisk benerosion och ledförstörelse 7,8, och nuvarande behandlingar förbättrar eller stoppar ofta inte benskadorna9,10,11. Förändringar i cirkulerande monocyter både vad gäller populationsfördelning och transkriptomiska och epigenetiska signaturer har rapporterats hos RA-patienter12,13,14. Dessutom har det rapporterats att förändrade monocytsvar på inflammatorisk stimulering påverkar osteoklastogenes hos RA-patienter med aktiv sjukdom15,16,17.
Differentieringen av OC är en komplex flerstegsprocess som innefattar involvering av myeloida prekursorceller för differentiering till OC-prekursorer. Under osteoklastogenes blir OC jätte och flerkärnig genom cell-cellfusion, ofullständig cytokinese och en kärnåtervinningsprocess som beskrivs som fission och fusion18,19,20. Förmågan att differentiera p-piller in vitro har möjliggjort betydande framsteg i förståelsen av benbiologi21. OC skiljer sig från prekursorer vid exponering för makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF) och receptoraktivator för nukleär faktor kappa-B-ligand (RANKL). Det senare är viktigt för normal utveckling och funktion av p-piller in vitro och in vivo, även under inflammatoriska tillstånd 6,22,23. RANKL presenteras av osteoblaster och osteocyter, samt av aktiverade T-celler och fibroblaster i inflammerat RA-synovium 2,24,25. Under OC-differentieringsprocessen uppreglerar monocyter som exponerats för M-CSF receptoraktivator för kärnfaktorkappa-B (RANK) -uttryck på deras cellmembran och, under efterföljande stimulering med RANKL, differentieras till tartrat resistent surt fosfatas (TRAP)-positiva mononukleära pre-OCs och sedan till multinucleated OCs15,26. OC producerar flera enzymer, den främsta bland dem är TRAP, som möjliggör nedbrytning av fosfoproteiner i ben27. En regulator och markör för OC-differentiering är den OC-associerade receptorn (OSCAR). Det uppregleras tidigt i prekursorceller som förbinder sig till OC-linjen28. Mogna jätte flerkärniga OC kan bryta ner (resorbera) skelettmatrisen genom att generera en stor tätningszon, som är gjord av en aktinring som omger en rufsig kant21,29,30. Benresorptionsförmågan hos OC kräver cytoskelettomorganisation och därmed polarisering och bildning av ett krökt membran, vilket är den så kallade ruffled gränsen. Den rufsiga gränsen är omgiven av ett stort cirkulärt band av en F-aktinrik struktur, som är aktinringen eller tätningszonen. Aktinringintegritet är avgörande för att OC ska resorbera ben både in vitro och in vivo, och defekt ruffled kantbildning är associerad med lägre vakuolär adenosintrifosfatas (V-ATPas) uttryck31,32,33. Dessutom är OC mitokondririka celler, och adenosintrifosfat (ATP) associeras med mitokondriella strukturer i OC lokaliserade vid den rufflade gränsen31,32,33. Rotenon verkar som en stark hämmare av mitokondriellt komplex I och påverkar ATP-produktionen. Rotenon har också visat sig hämma OC-differentiering och funktion34.
Detta protokoll beskriver en effektiv och optimerad metod för in vitro osteoklastogenes från humana perifera blodprover. I humant perifert blod är CD14 + -monocyter huvudkällan till OC15,35,36. I detta protokoll har exponeringskinetiken och koncentrationerna av M-CSF och RANKL justerats för optimal osteoklastogenes. Mononukleära celler separeras först från erytrocyterna och granulocyterna närvarande i helblod genom densitetsgradient; de berikas sedan för CD14 + -monocyter med hjälp av positivt urval med magnetiska pärlor. De isolerade CD14 + monocyterna inkuberas sedan över natten med M-CSF. Detta primar monocyterna för att uppreglera uttrycket av RANK15,26. Den efterföljande tillsatsen av RANKL inducerar osteoklastogenes och multinukleation på ett tidsberoende sätt. Aktivt resorberande OC visar den karakteristiska fördelningen av F-aktinringar vid kanten av cellmembranet30,32 och färgning för TRAP. Mogna OCs analyseras genom att kvantifiera TRAP+ flerkärniga (mer än tre kärnor) celler. Den funktionella kapaciteten hos mogna OC kan bedömas genom deras resorption, aktinringintegritet och ATP-produktion. Dessutom kan differentierade CD14− OSCAR+ OCs anrikas och användas för att bedöma effekterna av vissa föreningar på OC-funktionalitet via mineralresorption (eller dentin) och F-aktinorganisation. I detta arbete används dessutom en känd OC-hämmare, rotenon, som ett exempel på en förening som påverkar funktionaliteten hos OC. Minskad OC-resorptionsaktivitet under rotenon är förknippad med minskad ATP-produktion och aktinringfragmentering. Sammanfattningsvis etablerar detta protokoll en robust analys som kan användas som referensmetod för att studera flera biologiska aspekter av OC-differentiering och funktion in vitro.
Denna metod kan användas för att bedöma (1) potentialen hos cirkulerande monocyter att differentiera till OC i hälsa och sjukdomar, samt (2) effekten av terapeutiska kandidater på OC-differentiering och funktion. Detta robusta osteoklastogenesprotokoll möjliggör bestämning av effekt och mekanismer för benriktade terapier på både OC-differentiering från prekursorceller och funktionen hos mogna OC.
Enkel odling och isolering av ett stort antal funktionella OCs in vitro är viktiga för att öka förståelsen av benbiologi och OC-medierade sjukdomar. Klassiskt genererades OC i samkulturer med osteoblaster eller stromaceller och hematopoetiska celler från mjälten eller benmärgen38,39. Ett betydande genombrott i förståelsen av osteoklastogenes var identifieringen av RANKL som den viktigaste regulatorn för OC-bildning, differentiering och överlevnad40. Tidiga protokoll för RANKL-beroende kultursystem använde PBMC för OC-generering21,41,42. Dessa blandade kulturer är dock långa och presenterar många förvirrande faktorer som begränsar möjligheten att testa de direkta effekterna på OC-differentiering och funktion. Detta protokoll beskriver en effektiv och tillförlitlig in vitro-modell av osteoklastogenes från humana perifera CD14 + -monocyter där optimal osteoklastogenes kan erhållas inom 7 dagar (figur 1 och figur 2), vilket är betydligt snabbare jämfört med vissa andra protokoll43,44,45,46. De viktigaste kännetecknen för detta protokoll är (1) användningen av renade CD14 + -monocyter, (2) priming av monocyterna med M-CSF före exponering för RANKL, (3) kulturens längd (<7 dagar) och (4) tillförlitlig detektion av hämning av OC-bildning (TRAP-färgning) och funktion (resorption, ATP-produktion, aktinringomorganisation) med hämmare.
Under optimeringen av metodiken identifierades flera kritiska punkter. Det har observerats att in vitro-differentieringen av OCs till stor del är beroende av sådddensiteten hos CD14 + -monocyterna. Således seedas cellerna i detta protokoll med hög densitet (1 x 105 celler / brunn av en 96-brunnsplatta, i 100 μL medium), eftersom det är viktigt för cellerna att kunna interagera med varandra och att vara i närheten av säkring och bli mogna OC. På samma sätt begränsar såddceller med en densitet som är för hög deras differentiering och tillväxt på grund av medelbegränsningar och brist på det nödvändiga utrymmet. För att uppnå maximal framgång med detta protokoll är det dessutom viktigt att utföra densitetsgradientseparationen noggrant och se till att den anrikade populationen av CD14 + -celler är så ren som möjligt. Till exempel resulterar otillräckliga tvättsteg i brist på avlägsnande av blodplättar, vilket följaktligen hämmar OC-differentiering47,48. På liknande sätt kan förekomsten av mindre T-cellkontaminering i isolerade CD14 + -preparat stimulerade med M-CSF ensam resultera i OC-differentiering, potentiellt via RANKL-utsöndring av T-celler49. Därför är det viktigt att inkludera en M-CSF-kontroll för varje experiment. En rutinmässig renhetskontroll, särskilt vid användning av en ny isoleringssats, rekommenderas också för att säkerställa provets renhet.
Optimala OC-tal (intervall: ~ 200-1,600 OC / brunn) uppnås med hjälp av α-MEM-medium berikat med nukleosider och L-glutamin. Andra konventionella odlingsmedier, inklusive Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) och Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium, påverkar OC-avkastningen. Källan till FBS kan också påverka osteoklastogenes. Olika satser av FBS kan leda till minskad RANK-L-härledd osteoklastogenes, liksom uppkomsten av lågt antal TRAP + flerkärniga celler i M-CSF-kontrollerna (kompletterande figur 3). För att uppnå konsekventa resultat rekommenderas därför att testa nya FBS-satser före användning och att fortsätta med samma sats under experimenten för att minimera variationer i differentieringsprocessen. Dessutom utgör variationen mellan givare och donatorer, när det gäller det totala antalet differentierade aktiva substanser som erhållits vid sluttidpunkten, en begränsning när man använder detta protokoll för att jämföra till exempel friska givare med patienter. I dessa fall är det absolut nödvändigt att använda exakt samma förhållanden och samma parti medium, FBS och andra reagens.
Ett annat nödvändigt steg för optimal OC-differentiering och mognad är att prima monocyterna med M-CSF före RANKL-tillsatsen. Cellernas exponering för M-CSF 18-24 timmar före RANKL primar monocyterna för att uppreglera RANK-uttryck15,26. Tillägg av RANKL vid denna tidpunkt säkerställer optimal OC-differentiering på ett dosberoende sätt. Graden av OC-differentiering varierar från givare till givare; 25 ng/ml RANKL är dock vanligtvis tillräckligt för att särskilja ett stort antal OC hos de flesta givare. Dessutom kan 25 ng/ml RANKL användas i analyser för initial screening av föreningar, eftersom det underlättar utvärderingen av både de förstärkande och hämmande effekterna av testföreningarna. Andra odlingssystem har använt längre M-CSF-förinkubationstider före RANKL-tillägg, men detta resulterar i en längre odlingstid för osteoklastogenes50. Dessutom lämnar de grundade monocyterna att inkubera över natten tillåter dem att fästa vid plattan, om än inte i ett helt vidhäftande tillstånd. Därför, när RANKL introduceras för första gången, måste mediet bytas mycket noggrant snarare än helt ändras för att förhindra lossning och förlust av de grundade monocyterna. Mediet måste också uppdateras var 3-4: e dag för att undvika medelutarmning och förhindra celldöd. På grund av den låga volym som används i denna analys (100 μl/brunn i en platta med 96 brunnar) är det dessutom av yttersta vikt att ha en ram av tomma brunnar som är fyllda med en vattenlösning (dvs. steril destilleradH2Oeller PBS) runt analysbrunnarna. Detta förhindrar medium avdunstning och kanteffekter.
Slutligen, för metaboliska analyser (t.ex. ATP-analyser) är det absolut nödvändigt att cellerna är livskraftiga för att undvika stor standardavvikelse mellan replikaten (figur 5). Hög livskraft hos cellerna är också viktigt för sortering av cellerna och för vidare odling av de sorterade OC (figur 4). Denna metod har dock flera begränsningar. Fullt mogna OC är mycket vidhäftande och svåra att lossa från plattorna. De större OC är ofta omöjliga att lossa, vilket kan leda till ett lägre cellutbyte. Därför måste cellerna räknas efter sortering och före plätering vid önskad koncentration. I detta protokoll används dessutom en icke-enzymatisk metod (accutas) för att lossa p-p-ämnena för att förhindra membranförändringar i nedströms ytfärgning för flödescytometri. Användningen av cellskrapor (både med mjuka eller hårda ändar) testades också och ledde till hög celldöd. Enzymatisk avskiljning med 0,05% trypsin / EDTA-lösningar kan användas för ett högre utbyte av fristående OCs när membranintegritet inte krävs för nedströmsapplikationer. Dessutom, för att förhindra att p-piller klumpar ihop, rekommenderas starkt användning av en hög koncentration av EDTA i alla buffertar efter cellavskiljning, liksom lämplig filtrering före flödescytometriförvärv. Det är viktigt att notera att OC-kulturer är en heterogen population av celler som består av mogna OC, OC-prekursorer och makrofager. Makrofager kan lätt skiljas från OC, även om både mononukleära pre-OC och multinukleära OC uttrycker OSCAR och inte kan särskiljas med den nuvarande metoden (figur 4). Den sistnämnda frågan utgör faktiskt den huvudsakliga begränsningen med denna metod. Dessutom finns ett lågt uttryck av OSCAR också i M-CSF-kulturer (figur 4B) och kan indikera makrofager som är grundade för OC-härstamningsåtagande. Det är viktigt att ställa in grinden för OSCAR+ -celler baserat på FMO-färgningssignalen, som visas i figur 4B.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll en optimerad och robust metod för effektiv produktion av aktiva och funktionellt mogna OCs från cirkulerande primära humana monocyter. Styrkan i detta protokoll är dess förmåga att generera OC på kort tid och ge ett stort antal differentierade OC. Denna metod öppnar för att undersöka de grundläggande mekanismerna bakom OC-differentiering och funktion.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Flow Core Facility och Glasgow Imaging Facility (GIF) inom School of Infection and Immunity för deras stöd och hjälp i detta arbete.
µ-Slide 18 well chamber slides | ibidi | 81816 | |
8-well glass chamber slides | Ibidi | 80807 | |
96-well TC plate | Corning | 3596 | |
96-well osteo assay stripwell plate | Corning | 3989 | |
Acetate solution | Sigma Aldrich | 386-3 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Acetone | VWR | 20066.330 | |
Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit | SIGMA-ALDRICH | 387A-1KT | |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Theremo Fisher – Invitrogen | A12379 | AF488 |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher – Invitrogen | A22287 | AF647 |
Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose | Fisher Scientific | 11321867 | 2DG, 98% |
Alpha minimum essential medium | gibco | 22571-020 | |
ATPlite 1step | PerkinElmer | 6016731 | Luminiscence ATP detection assay system |
BD FACSAria III cell sorter | BD Biosciences | ||
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom | Greiner bio-one | 655083 | White-bottom plates |
Citrate solution | Sigma Aldrich | 91-5 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes | Fisher Scientific | 352054 | |
Corning osteo assay surface multiple well plate | Sigma-Aldrich | CLS3989 | |
Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell | Corning | CLS3989-2EA | |
DAPI | Theremo Fisher | D3571 | |
EasySep human CD14 positive selection kit | STEMCELL Technologies | 17858 | |
EasySep red blood cell lysis buffer (10x) | StemCell Technologies | 20110 | |
eBioscience fixable viability dye eFluor 780 | Theremo Fisher – Invitrogen | 65-0865-14 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E7889-100ML | |
EVOS FL auto imaging system | Thermo Fisher | A32678 | |
Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap | Fisher Scientific | 10314791 | |
Falcon tubes 15 mL | Corning | 430790 | |
Falcon tubes 50 mL | Corning | 430828 | |
Fast Garnet GBC base solution | Sigma Aldrich | 387-2 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Fetal bovine serum | gibco | 10500-064 | FBS |
Ficoll-Paque Plus | cytiva | 17144003 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F-8775 | |
Human sRANK ligand | PEPROTECH | 310-01-100UG | Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL) |
ImageJ Image analysis software | Image J | version 2.9.0 | |
L-glutamine | gibco | 25030-024 | |
Lithium heparin tubes (9 mL) | VACUETTE | 455084 | |
Macrophage colony-stimulating factor | PEPROTECH | 300-25-100UG | M-CSF |
Napthol AS-BI phosphoric acid solution | Sigma Aldrich | 387-1 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Neubauer hemacytometer counting chamber | Camlab | SKU 1127885 | |
Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes | Sigma-Aldrich | Q4876-5MG | |
OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit | Miltenyi Biotec | 130-107-661 and 130-107-617 | Clone REA494 |
PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody | Biolegend | 325618 | Clone HCD14 |
Penicilin/streptomycin | SIGMA | P0781 | |
PHERAstar machine and software | BMG LABTECH | ||
Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x) | gibco | 14190-094 | |
REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-443 | |
Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044-1L | |
Sodium nitrite solution | Sigma Aldrich | 91-4 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Tartrate solution | Sigma Aldrich | 387-3 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML |