Questo metodo descrive un saggio di sedimentazione in vitro basato sulla lectina per quantificare l'affinità di legame della fosfatasi glucana e dell'amilopectina. Questo saggio di co-sedimentazione è affidabile per misurare il legame del substrato della glucanofosfatasi e può essere applicato a vari substrati di glucano solubilizzati.
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Articolo metodologico
Saggio di sedimentazione basato sulla concanavalina A per misurare il legame del substrato delle fosfatasi glucane
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le fosfatasi glucane appartengono alla più ampia famiglia delle fosfatasi a doppia specificità (DSP) che defosforilate substrati di glucano, come il glicogeno negli animali e l'amido nelle piante. Le strutture cristalline della fosfatasi glucano con substrati di glucano modello rivelano distinte interfacce di legame glucano fatte di DSP e domini di legame dei carboidrati. Tuttavia, le misurazioni quantitative delle interazioni glucano-glucano-fosfatasi con substrati fisiologicamente rilevanti sono fondamentali per la comprensione biologica della famiglia di enzimi glucanofosfatasi e la regolazione del metabolismo energetico. Questo manoscritto riporta un saggio di sedimentazione in vitro basato sulla Concanavalina A (ConA) progettato per rilevare l'affinità di legame del substrato delle fosfatasi glucane contro diversi substrati glucani. Come prova del concetto, è stata determinata la costante di dissociazione (KD) della glucanofosfatasi Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) e dell'amilopectina. La caratterizzazione dei mutanti SEX4 e di altri membri della famiglia degli enzimi glucanofosfatasi dimostra ulteriormente l'utilità di questo test per valutare il legame differenziale delle interazioni proteina-carboidrati. Questi dati dimostrano l'idoneità di questo test a caratterizzare un'ampia gamma di proteine che interagiscono tra amido e glicogeno.
Introduzione
Le fosfatasi glucane sono membri di una sottofamiglia funzionalmente diversificata di fosfatasi a doppia specificità (DSP) all'interno dellasuperfamiglia 1 della proteina tirosina fosfatasi (PTP). Sono stati trovati nella maggior parte delle forme di vita, inclusi organismi fotosintetici ampiamente divergenti, esseri umani, vertebrati e alcuni invertebrati e protisti 2,3,4. Le piante contengono tre fosfatasi glucane note: Starch Excess4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) e Like Sex Four2 (LSF2)5,6,7....
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Protocollo
1. Preparazione delle perle ConA-Sepharose
- Produrre 250 mL di un tampone legante contenente 67 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl 2 e 0,2 mM CaCl2. Regolare il pH con una soluzione di NaOH 1 M.
- Pipettare 250 μL di sospensione di perline ConA-Sepharose in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Centrifugare il contenuto a 10.000 x g per 30 s a 4 °C. Scartare il surnatante.
NOTA: 250 μL di sfere di ConA-Sepharose in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL sono necessari per ogni concentrazione di amilopectina utilizzata per il test. - Aggiungere 750 μL del tampone legante a ciascun tubo cont....
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Risultati
Una delle caratteristiche chiave della famiglia di proteine della glucanofosfatasi è la loro capacità di legarsi ai substrati del glucano. In primo luogo, la capacità di legame di SEX4 a ConA-Sepharose:amylopectin beads è stata analizzata utilizzando SDS-PAGE (Figura 2A). L'albumina sierica bovina (BSA) è servita come controllo negativo per rilevare qualsiasi legame non specifico delle proteine alle perle ConA-Sepharose:amilopectina. L'analisi SDS-PAGE delle proteine ha mostrato la presenza .......
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Discussione
Questo studio dimostra il successo dello sviluppo di un nuovo saggio di sedimentazione in vitro che consente di determinare l'affinità di legame delle interazioni glucano-glucano-fosfatasi. Il progetto del saggio sfrutta il legame specifico della lectina ConA ai glucani attraverso i residui idrossilici del glucosio per catturare indirettamente substrati di carboidrati solubilizzati su perle di salsorosio. Ciò consente la separazione delle frazioni proteiche legate e non legate tramite centrifug.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo studio è stato supportato dal premio della National Science Foundation MCB-2012074. Gli autori ringraziano il Dr. Craig W. Vander Kooi del Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare dell'Università della Florida per le preziose discussioni e supporto. Gli autori ringraziano anche il Dr. Matthew S. Gentry del Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare dell'Università della Florida per il suo supporto. Vorremmo ringraziare la dottoressa Sara Lagalwar, presidente del programma di neuroscienze dello Skidmore College, per averci permesso di utilizzare lo scanner LICOR C-digit blot per l'imaging western blot.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anticorpo monoclonale 6x-His Tag (HIS. H8), HRP | Therm Fisher Scientific | MA1-21315-HRP | |
| Biorad gel electrophoresis e Western blot kit | Biorad | ||
| Cloruro di calcio | Sigma-Aldrich | 208291 | |
| C-Digit blot scanner | LICOR | 3600-00 | Blot scanner |
| Cocktail completo di inibitori della proteasi | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| Concanavalin A-sepharose beads | Sigma-Aldrich | C9017 | Questo prodotto contiene in tampone acetato 0,1 M, pH 6, contenente 1 M di NaCl, 1 mM di CaCl2, 1 mM di MnCl2 e 1 mM di MgCl2 in etanolo al 20%... |
| Centrifuga | Eppendorf | 5425R | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | Versione 8.0 | Software di analisi dei dati |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H8651 | |
| Image Studio | LICOR | 3600-501 | Software |
| di acquisizione Cloruro di magnesio | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Metanolo | Fisher Scientific | A452SK-4 | |
| Sodio dodecil solfato | Fisher Scientific | PI28312 | |
| Amilopectina di patate | Sigma-Aldrich | A8515 | |
| Gel SDSPAGE prefabbricati | Genscript | M00653S | |
| base Tris | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | MP1TWEEN201 | |
| Substrato di chemiluminescenza premium Westernsure | LI-COR | 926-95000 |
Riferimenti
- Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism. The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).
- Gentry, M. S., et al. The phosphatase la....
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Ristampe e permessi
