I den aktuella studien administreras fluorescein-isotiocyanatmärkt (FITC) dextran till möss via oral sondmatning för att utvärdera tarmpermeabiliteten både in vivo och i plasma- och fekalprover. Eftersom tarmbarriärfunktionen påverkas i många sjukdomsprocesser kan denna direkta och kvantitativa analys användas inom olika forskningsområden.
Tarmbarriärens integritet är ett kännetecken för tarmhälsan. Medan tarmbarriärens integritet kan bedömas med hjälp av indirekta markörer såsom mätning av plasmainflammatoriska markörer och bakteriell translokation till mjälten och lymfkörtlarna, kvantifierar guldstandarden direkt förmågan hos utvalda molekyler att korsa tarmslemhinnans skikt mot systemisk cirkulation. Denna artikel använder en icke-invasiv, kostnadseffektiv och låg börda teknik för att kvantifiera och följa i realtid tarmpermeabiliteten hos möss med hjälp av fluorescein-isotiocyanatmärkt dextran (FITC-dextran). Före oralt tillskott med FITC-dextran fastas mössen. De sonderas sedan med FITC-dextran utspädd i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). En timme efter sondmatningen utsätts mössen för narkos med isofluran och in vivo-fluorescensen visualiseras i en avbildningskammare. Denna teknik syftar till att bedöma kvarvarande fluorescens i bukhålan och leverupptaget, vilket tyder på portalmigration av den fluorescerande sonden. Blod- och avföringsprover samlas in 4 timmar efter oral sondmatning och mössen offras. Plasma- och fekalprover utspädda i PBS pläteras sedan och fluorescensen registreras. Koncentrationen av FITC-dextran beräknas sedan med hjälp av en standardkurva. I tidigare forskning har in vivo-avbildning visat att fluorescens snabbt sprider sig till levern hos möss med en svagare tarmbarriär inducerad av en fiberfattig diet, medan hos möss kompletterade med fiber för att stärka tarmbarriären behålls den fluorescerande signalen mestadels i mag-tarmkanalen. Dessutom hade kontrollmöss i denna studie förhöjd plasmafluorescens och minskad fluorescens i avföringen, medan omvänt hade inulinkompletterade möss högre nivåer av fluorescenssignaler i tarmen och låga nivåer i plasma. Sammanfattningsvis ger detta protokoll kvalitativa och kvantitativa mätningar av tarmpermeabilitet som en markör för tarmhälsa.
Tarmbarriären spelar en viktig roll för både hälsa och sjukdom. Det kräver en komplex balans mellan att låta de nödvändiga näringsämnena tränga in i cirkulationen från tarmlumen och samtidigt förhindra penetrering av proinflammatoriska molekyler, såsom patogener eller antigener1. Ökad permeabilitet kan orsakas av många gastrointestinala störningar, såsom leversjukdom eller inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD)2,3. Till exempel, vid ulcerös kolit (UC), en IBD, leder kronisk inflammation till nedbrytning av snäva korsningar, efterföljande störning av tarmbarriären och translokation av bakterier, vilket potentiellt upprätthåller mukosal och systemisk inflammation4.
Tarmbarriärens integritet är därför en viktig markör för tarmhälsa. Nuvarande metoder för mätning av tarmpermeabilitet har dock många begränsningar. Till exempel är metoder som mäter plasmainflammatoriska markörer eller bakteriell translokation till mjälte och lymfkörtlar indirekta 5,6. Andra metoder kan vara invasiva och tidskrävande. Denna artikel beskriver en icke-invasiv och kostnadseffektiv analys som direkt och kvantitativt mäter tarmpermeabiliteten. Denna analys använder fluorescein-isotiocyanatmärkt dextran (FITC-dextran) för att följa tarmpermeabiliteten i realtid genom att mäta fluorescens in vivo. Dessutom kvantifierar mätning av FITC-dextrannivåer i plasma och avföring tarmpermeabiliteten (figur 1).
FITC-dextran-permeabilitetsanalysen har tidigare använts i många olika sammanhang, bland annat i djurmodeller av Parkinsons sjukdom7, sepsis8, ischemisk stroke9 och brännskada10. Dessutom har denna analys nyligen använts för att hjälpa till att förstå hur tarmmikrobiomet kan vara inblandat i olika sjukdomsprocesser och hur det kan riktas eller manipuleras som en potentiell terapeutisk. Det har till exempel använts för att studera mikrobiomet och mikrobiombaserade terapier vid åldrande 11, IBD 12, kolorektal cancer13 och autismspektrumstörning11. Eftersom tarmbarriärfunktionen är inblandad i många aspekter av hälsa och sjukdom har denna analys använts i stor utsträckning. Dess relativa enkelhet och låga tidsbörda gör den idealisk för att testa in vivo-förhållanden som misstänks förändra tarmbarriärens integritet. Dess kvantitativa resultat är användbara för att bestämma effektiviteten av en potentiell behandling.
I denna studie utvärderades effekten av kost på tarmbarriärfunktionen med hjälp av FITC-dextran-analysen. Tarmens permeabilitet hos möss som fick en kontrolldiet och tarmpermeabiliteten hos möss som fick en inulinkompletterad diet jämfördes. Inulin är en fördelaktig oligosackarid som har visat sig förbättra tarmbarriärfunktionen12,13. För fluorescensmätningar in vivo (bakgrund) användes ytterligare en obehandlad mus som negativ kontroll och fick PBS istället för FITC-dextran. Detta experiment visar att FITC-dextran-analysen är ett värdefullt verktyg för att utvärdera tarmpermeabiliteten.
Tarmbarriärfunktionen är en integrerad del av många olika sjukdomsprocesser. Således är det viktigt att bedöma tarmpermeabiliteten på ett icke-invasivt, kostnadseffektivt och kvantifierbart sätt för att exakt representera dessa sjukdomar i djurmodeller. FITC-dextran-analysen ger möjlighet till denna representation. Detta protokoll innebär dock flera kritiska steg som måste slutföras exakt för att få tillförlitliga resultat. För det första är det viktigt att se till att FITC-dextran används av lämplig storlek. För undersökning av permeabilitet in vivo är 4 kDa FITC-dextran den optimala molekylvikten, och när molekylvikten ökar minskar permeabiliteten15. Således kan användning av FITC-dextran med en annan molekylvikt ge förvirrande eller opålitliga resultat. Dessutom är det viktigt att notera tidpunkten för varje sondmatning och att justera tidpunkterna för datainsamling in vivo och insamling av plasma och avföring i enlighet därmed. Till exempel, om två möss sondas med 10 minuters mellanrum, måste in vivo-fluorescensavläsningarna och insamlingen av avföring och plasma också ske med 10 minuters mellanrum. Att jämföra fluorescensen vid samma tidpunkter möjliggör en mer exakt representation av skillnaderna i permeabilitet. Dessutom bör den ordning i vilken djuren från olika grupper testas alterneras för att förhindra en klustereffekt på grund av tidpunkten. Istället för att testa alla djur i grupp A först, sedan alla djur i grupp B andra (AAABBB), rekommenderas att gruppen byts ut efter varje djur (ABABAB).
Denna analys kan modifieras för att endast inkludera utvärdering av plasma- och fekalprover om det saknas tillgång till en bildmaskin. Även om direkt fluorescensavbildning in vivo möjliggör visualisering av leverintag och kvarvarande bukfluorescens, ger utvärdering av fluorescens i plasma och fekalprover fortfarande en kvantitativ mätning av tarmpermeabiliteten. Dessutom, som demonstrerats av det beskrivna experimentet, korrelerar fluorescensnivåerna i plasma och avföring väl med in vivo-avbildningen. Dessutom kan denna analys modifieras för att endast inkludera in vivo-avbildning . Detta gör att djuren kan hållas vid liv för att fortsätta testa andra parametrar eller övervaka hur tarmpermeabiliteten förändras över tiden. Möjligheten att modifiera denna analys gör den därför tillgänglig, men ändå kvantitativ. Slutligen har doseringen av 200 μl 80 mg·ml−1 FITC-dextran som ges till varje mus använts tidigare och visat sig vara effektiv hos möss med små skillnader i kroppsvikt16. Dessutom är det viktigt att notera att alla möss som användes i avsnittet representativa resultat vägde cirka 20 g, vilket gör att samma dos kan användas för varje mus. För att ta hänsyn till skillnader i kroppsvikt kan FITC-dextran administreras i en dos av 0,6-0,8 mg/g kroppsvikt, till exempel17. Oavsett vilken dos som används är det viktigt att begränsa mängden som sonderas till varje mus till mindre än 10 ml · kg-1 för att förhindra komplikationer eller obehag18.
Även om FITC-dextran-analysen ger en effektiv metod för att utvärdera tarmbarriärfunktionen, har den fortfarande vissa begränsningar. En begränsning med denna modell är att den kräver fasta mössen i flera timmar, vilket innebär att det är opålitligt att jämföra dessa resultat med de från möss som inte har fastats. Dessutom kan fasta påverka resultaten i vissa modeller som kräver strikta utfodringsscheman, till exempel vid mätning av blodsocker i djurmodeller för diabetes.
Trots dessa begränsningar är FITC-dextran-analysen fortfarande en effektiv metod för att analysera tarmpermeabilitet eftersom den är kvantitativ, mångsidig, kostnadseffektiv och mindre invasiv än många klassiska metoder. Vanliga sonder som används för att mäta tarmpermeabilitet är till exempel små sackaridprober eller Cr-EDTA, som har vissa fördelar19. Vissa sackaridsonder har dock endast regionspecifik permeabilitet. Eftersom de hydrolyseras i den distala delen av tunntarmen, ger de ingen inblick i kolonpermeabilitet19. Å andra sidan kan Cr-EDTA ge information om kolonpermeabilitet men kräver mätningar i 24 timmar, vilket gör tidsbördan för denna metod mycket högre än för FITC-dextrananalys20. Dessutom tillhandahåller ingen av dessa metoder direkt in vivo-avbildning av denna analys. Därför ger FITC-dextran-analysen ett relativt enkelt, direkt och effektivt alternativ jämfört med alternativa metoder för mätning av tarmpermeabilitet.
Slutligen, i sjukdomsprocesser som IBD4, Alzheimers sjukdom21 och leversjukdom2, är tarmpermeabilitet en viktig parameter som kan mätas med hjälp av FITC-dextran-analysen för att förbättra studierna. Till exempel, vid utveckling av nya behandlingar, såsom immunterapier för IBD, kan denna analys användas för att testa effekten av den terapeutiska för att upprätthålla tarmbarriärens integritet. Med tanke på att nedsatt tarmbarriärfunktion kan vara inblandad i att upprätthålla den kroniska inflammationen vid UC, till exempel, är det viktigt att undersöka hur väl en terapeutisk skyddar mot ökad permeabilitet4. Detta är bara ett exempel, men FITC-dextran-analysen är ett tillgängligt och kvantifierbart sätt att mäta tarmpermeabilitet inom många olika områden och aspekter av forskning.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av ett bidrag från Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (bidrag RGPIN-2018-06442 till MMS). Vi tackar djuranläggningen vid CRCHUM och Dr. Junzheng Peng från Cardiovascular Phenotyping Platform.
50 ppm Fe Diet (10% Inulin) | Envigo Teklad | TD.190651 | Representative Results |
50 ppm Fe Diet (FeSO4) | Envigo Teklad | TD.190723 | Representative Results |
BALB/c Mice 49-55 Days, Female | Charles River | 028BALB/C | Representative Results |
BD 1 mL Syringe Tuberculin Slip Tip | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For gavage |
BD Microtainer Tubes – With LH (Lithium Heparin) | Becton, Dickinson and Company | 365965 | For plasma collection |
Centrifuge 5420 | Eppendorf | S420KN605698 | |
Curved Gavage Needle (Gavage Cannula) 7.7.0 38 mm x 22 G | Harvard Apparatus Canada | 34-024 | No longer available – A potential alternative is available at Instech Labs (FTP-22-38) |
Euthanyl (Pentobarbital Sodium) 240 mg/mL | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 141704 | 1/100 dilution; Administered via intraperitoneal injection at 0.03 mL/g body weight |
FITC-dextran 4 | TdB Labs | 20550 | |
Heparinized Capillary Tubes | Kimble Chase Life Science and Research | 2501 | For retro-orbital blood collection |
Microplate, PS, 96-well, Flat-bottom (Chimney Well), Black, Flutrac, Med. Binding | Greiner Bio-one | 655076 | |
MiniARCO Clipper Kit | Kent Scientific | CL8787-KIT | For hair removal |
Optix MX2 and Optix Optiview | Advanced Research Technologies | 2.02.00.6 | Fluorescence imaging machine and software |
Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Wisent Inc | 311-010-LL | |
Puralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | Ophthalmic ointement to prevent eye damage during anesthesia |
Spark Multiplate Reader | Tecan | 30086376 |