Summary
In der vorliegenden Studie wird Fluorescein-Isothiocyanat-markiertes (FITC) Dextran Mäusen über eine orale Sonde verabreicht, um die Darmpermeabilität sowohl in vivo als auch in Plasma- und Kotproben zu bewerten. Da die Barrierefunktion des Darms bei vielen Krankheitsprozessen beeinträchtigt ist, kann dieser direkte und quantitative Assay in verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt werden.
Abstract
Die Integrität der Darmbarriere ist ein Kennzeichen der Darmgesundheit. Während die Integrität der Darmbarriere anhand indirekter Marker wie der Messung von Plasma-Entzündungsmarkern und der bakteriellen Translokation in Milz und Lymphknoten beurteilt werden kann, quantifiziert der Goldstandard direkt die Fähigkeit ausgewählter Moleküle, die Darmschleimhautschicht in Richtung des systemischen Kreislaufs zu durchqueren. Dieser Artikel verwendet eine nicht-invasive, kostengünstige und aufwandsarme Technik, um die Darmpermeabilität bei Mäusen unter Verwendung von Fluorescein-Isothiocyanat-markiertem Dextran (FITC-Dextran) in Echtzeit zu quantifizieren und zu verfolgen. Vor der oralen Supplementierung mit FITC-Dextran werden die Mäuse nüchtern. Anschließend werden sie mit FITC-Dextran verdünnt, das in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt ist. Eine Stunde nach der Sonde werden die Mäuse einer Vollnarkose mit Isofluran unterzogen und die In-vivo-Fluoreszenz in einer Bildgebungskammer sichtbar gemacht. Diese Technik zielt darauf ab, die Restfluoreszenz in der Bauchhöhle und die Leberaufnahme zu bewerten, was auf eine portale Migration der Fluoreszenzsonde hindeutet. Blut- und Stuhlproben werden 4 Stunden nach der oralen Sonde entnommen und die Mäuse werden getötet. Plasma- und Stuhlproben, die in PBS verdünnt sind, werden dann plattiert und die Fluoreszenz wird aufgezeichnet. Die Konzentration von FITC-Dextran wird dann anhand einer Standardkurve berechnet. In früheren Forschungen hat die In-vivo-Bildgebung gezeigt, dass sich die Fluoreszenz bei Mäusen mit einer schwächeren Darmbarriere, die durch eine ballaststoffarme Ernährung induziert wird, schnell auf die Leber ausbreitet, während bei Mäusen, die mit Ballaststoffen zur Stärkung der Darmbarriere ergänzt wurden, das Fluoreszenzsignal hauptsächlich im Magen-Darm-Trakt erhalten bleibt. Darüber hinaus hatten Kontrollmäuse in dieser Studie eine erhöhte Plasmafluoreszenz und eine reduzierte Fluoreszenz im Stuhl, während umgekehrt Inulin-ergänzte Mäuse höhere Fluoreszenzsignale im Darm und niedrige Spiegel im Plasma aufwiesen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll qualitative und quantitative Messungen der Darmpermeabilität als Marker für die Darmgesundheit liefert.
Introduction
Die Darmbarriere spielt sowohl bei der Gesundheit als auch bei der Krankheit eine wichtige Rolle. Es erfordert ein komplexes Gleichgewicht zwischen dem Eindringen der benötigten Nährstoffe aus dem Darmlumen in den Kreislauf und der gleichzeitigen Verhinderung des Eindringens von entzündungsfördernden Molekülen wie Krankheitserregern oder Antigenen1. Eine erhöhte Durchlässigkeit kann durch viele Magen-Darm-Erkrankungen wie Lebererkrankungen oder entzündliche Darmerkrankungen (CEDs) verursacht werden2,3. Bei Colitis ulcerosa (UC), einer IBD, führt eine chronische Entzündung beispielsweise zum Abbau von Tight Junctions, zur anschließenden Störung der Darmbarriere und zur Translokation von Bakterien, wodurch möglicherweise die Schleimhaut und die systemische Entzündung aufrechterhaltenwerden 4.
Die Integrität der Darmbarriere ist daher ein wichtiger Marker für die Darmgesundheit. Die derzeitigen Methoden zur Messung der Darmpermeabilität haben jedoch viele Einschränkungen. Zum Beispiel sind Methoden zur Messung von Plasma-Entzündungsmarkern oder bakterieller Translokation in Milz und Lymphknoten indirekt 5,6. Andere Methoden können invasiv und zeitintensiv sein. Dieser Artikel beschreibt einen nicht-invasiven und kostengünstigen Assay, der die intestinale Permeabilität direkt und quantitativ misst. Dieser Assay verwendet Fluorescein-Isothiocyanat-markiertes Dextran (FITC-Dextran), um die Darmpermeabilität in Echtzeit durch Messung der Fluoreszenz in vivo zu verfolgen. Darüber hinaus quantifiziert die Messung des FITC-Dextran-Spiegels im Plasma und Kot die intestinale Permeabilität (Abbildung 1).
Der FITC-Dextran-Permeabilitätstest wurde bereits in vielen verschiedenen Kontexten verwendet, unter anderem in Tiermodellen der Parkinson-Krankheit7, Sepsis8, ischämischem Schlaganfall9 und Verbrennungsverletzungen10. Darüber hinaus wurde dieser Assay kürzlich verwendet, um zu verstehen, wie das Darmmikrobiom an verschiedenen Krankheitsprozessen beteiligt sein kann und wie es als potenzielles Therapeutikum gezielt eingesetzt oder manipuliert werden kann. Zum Beispiel wurde es verwendet, um das Mikrobiom und Mikrobiom-basierte Therapeutika im Alter 11, IBDs12, Darmkrebs 13 und Autismus-Spektrum-Störung11 zu untersuchen. Da die Darmbarrierefunktion an zahlreichen Aspekten von Gesundheit und Krankheit beteiligt ist, wurde dieser Assay häufig verwendet. Aufgrund seiner relativen Einfachheit und seines geringen Zeitaufwands eignet es sich ideal zum Testen der In-vivo-Bedingungen, bei denen der Verdacht besteht, dass sie die Integrität der Darmbarriere verändern. Seine quantitativen Ergebnisse sind nützlich, um die Wirksamkeit einer potenziellen Behandlung zu bestimmen.
In dieser Studie wurde die Wirkung der Ernährung auf die Darmbarrierefunktion mit dem FITC-Dextran-Assay bewertet. Die intestinale Permeabilität von Mäusen, die eine Kontrolldiät erhielten, und die intestinale Permeabilität von Mäusen, die eine mit Inulin ergänzte Diät erhielten, wurden verglichen. Inulin ist ein nützliches Oligosaccharid, von dem gezeigt wurde, dass es die Darmbarrierefunktion verbessert12,13. Für In-vivo-Fluoreszenzmessungen (Hintergrund) wurde eine zusätzliche unbehandelte Maus als Negativkontrolle verwendet und erhielt PBS anstelle von FITC-Dextran. Dieses Experiment zeigt, dass der FITC-Dextran-Assay ein wertvolles Werkzeug zur Bewertung der Darmpermeabilität ist.
Protocol
Alle Verfahren wurden nach Genehmigung durch das Institutional Animal Care Committee des CRCHUM nach den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden acht Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse verwendet, die aus einer kommerziellen Quelle stammen (siehe Materialtabelle). Die Tiere erhielten 2 Wochen lang eine Nahrungsergänzung mit 10 % Inulin Gew.-%. Eine Kontrollgruppe erhielt eine ähnliche Diät, der das Inulinpräparat fehlte. Mäuse hatten ad libitum Zugang zur Nahrung. Eine Übersicht über den Assay ist in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des FITC-Dextran-Assays. T-4-4 h vor der Sonde wurde der Zugang zu Nahrungsmitteln entfernt. T0-FITC-Dextran wurde über eine orale Sonde verabreicht. T1 - 1 h nach der Sonde wurde die in vivo Fluoreszenz ausgewertet. T4-4 h nach der Sonde wurden die Stuhl- und Plasmaproben entnommen und die Fluoreszenz gemessen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
1. Verabreichung von FITC-Dextran
- Fasten Sie die Mäuse vor der Verabreichung von FITC-Dextran 4 Stunden lang, während Sie ad libitum Zugang zu Wasser haben.
HINWEIS: Das Fasten muss vorzugsweise zu Beginn des Lichtzyklus (morgens) begonnen werden. Die Mäuse können während des Fastens ohne Einstreu in einen neuen Käfig gebracht werden, um die Koprophagie zu begrenzen. - Es werden 200 μl 80 mg·ml−1 4 kDa FITC-Dextran (siehe Materialtabelle) in steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (pro Maus) verdünnt. Bereiten Sie die Proben unmittelbar vor der Verabreichung frisch vor und bewahren Sie sie vor Licht geschützt auf.
- Verabreichen Sie jeder Maus 200 μl der FITC-Dextran-Suspension über eine orale Sonde mit einer sterilisierten, gebogenen 38-mm-22-G-Sondennadel mit einer kugel- oder birnenförmigen Spitze (siehe Materialtabelle). Starten Sie einen Timer nach der ersten Songage und warten Sie 5-10 Minuten, bevor Sie die nächste Maus gavieren, um In-vivo-Messungen zu ermöglichen (Schritt 2), wobei Sie immer 1 h nach der Sondierung beibehalten. Behalten Sie die verbleibende FITC-Dextran-Aufhängung für die Standardkurve bei.
HINWEIS: Unmittelbar nach der Sonde kann das Futter ausgetauscht werden, um die Bildung von Kot zu gewährleisten.
2. In-vivo-Fluoreszenzmessung
- Anästhesieren Sie die Mäuse 1 h nach der Sonde mit 2,5% Isofluran oder einem alternativen Anästhetikum. Vergewissern Sie sich, dass das Tier angemessen betäubt ist, indem Sie den Zeh oder den Schwanz einklemmen und sicherstellen, dass das Tier nicht reagiert.
- Entfernen Sie das Fell mit einem Elektrorasierer aus dem Bauchbereich und tragen Sie großzügig eine ophthalmologische Gleitsalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Platzieren Sie dann die Mäuse einzeln in der dorsal liegenden Bildgebungskammer.
HINWEIS: Es muss eine Kontrollmaus enthalten sein, die PBS oder Kochsalzlösung anstelle von FITC-Dextran empfängt, um den Hintergrund während der In-vivo-Bildgebung zu berücksichtigen.
- Entfernen Sie das Fell mit einem Elektrorasierer aus dem Bauchbereich und tragen Sie großzügig eine ophthalmologische Gleitsalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Platzieren Sie dann die Mäuse einzeln in der dorsal liegenden Bildgebungskammer.
- Stellen Sie die Mäuse mit einer Fluoreszenz-Bildgebungskammer dar (siehe Materialtabelle). Nehmen Sie Bilder der Bauchregion auf, indem Sie die Laserlänge auf 470 nm und die Auflösung auf 2,0 mm einstellen.
- Starten Sie das Gerät und die Software, indem Sie auf die Starttaste klicken und diese gedrückt halten. Lassen Sie das System aufwärmen.
HINWEIS: Das System kann 20 Minuten oder länger zum Aufwärmen benötigen, daher muss das Gerät frühzeitig gestartet werden, um die Bildgebung der Mäuse 1 Stunde nach dem Zahnfleisch nicht zu beeinträchtigen. - Klicken Sie auf Gerätestatus und stellen Sie sicher, dass alle konfigurierten Geräte "OK" anzeigen, bevor Sie fortfahren.
- Wärmen Sie bei Bedarf den entsprechenden Laser auf, indem Sie auf Lasersteuerung klicken und dann auf die Schaltfläche Lasername des gewünschten Lasers klicken.
- Starten Sie eine neue Studie, indem Sie auf Neue Studie klicken. Speichern Sie unter der entsprechenden Datei mit dem gewünschten Namen.
- Klicken Sie auf Studienoptionen, geben Sie dann die Proben-ID ein und wählen Sie den richtigen Laser und das richtige Experiment aus.
- Öffnen Sie die Bildgebungskammer und legen Sie das Tier dorsal auf die Scanplatte. Sichern Sie die Gliedmaßen und den Schwanz mit Klebeband und stellen Sie sicher, dass Nase und Mund genau in die Anästhesieröhre passen, wobei 2,5% Isofluran erhalten bleiben.
- Stellen Sie die Höhe der Scanplatte so ein, dass der Scanbereich leicht ventral von der Mittellinie des Tieres entfernt ist. Stellen Sie die Platte ein, indem Sie den Einstellknopf in der Bildgebungskammer drehen. Schließen und verriegeln Sie die Tür der Bildgebungskammer.
- Wählen Sie den zu scannenden Bereich mit dem Zeichenwerkzeug aus. Schließen Sie die gesamte Breite des Abdomens von knapp über der Leber bis zum Rektum ein. Klicken Sie auf das Werkzeug Ändern , um den gezeichneten Bereich anzupassen.
- Stellen Sie die Scanauflösung auf 2,0 mm ein und klicken Sie dann auf Weiter. Sobald die Energieautomatisierung abgeschlossen ist, stellen Sie sicher, dass die Einstellungen korrekt sind, und nehmen Sie alle erforderlichen Anpassungen vor. Klicken Sie auf Start , um den Scan zu starten.
- Sobald der Scan abgeschlossen ist, nehmen Sie das Tier aus der Bildgebungskammer und legen Sie es in einen Inkubator, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten, während Sie sich von der Anästhesie erholen.
- Klicken Sie auf Studie fortsetzen , um die Einstellungen beizubehalten, und wiederholen Sie dann die Schritte 2.2.5-2.2.10, bis alle Mäuse gescannt wurden.
- Klicken Sie auf den Netzschalter und halten Sie ihn 3 Sekunden lang gedrückt, um die Bildgebungskammer auszuschalten.
- Starten Sie das Gerät und die Software, indem Sie auf die Starttaste klicken und diese gedrückt halten. Lassen Sie das System aufwärmen.
- Bewerten Sie die Fluoreszenz, indem Sie die abdominale Fluoreszenz jedes Tieres und der Kontrollmaus auf gleichmäßig skalierten Bildern mit einer Software vergleichen, die dem verwendeten Bildgebungssystem zugeordnet ist (siehe Materialtabelle).
- Öffnen Sie die Bilddateien, indem Sie sie unter dem gewählten Dateinamen suchen. Öffnen Sie alle Dateien, für die gleichzeitig Einstellungen synchronisiert wurden.
- Verwenden Sie in der Symbolleiste für Bildeinstellungen die Schaltflächen Bild synchronisieren und Skalierung synchronisieren, um die Einstellungen für die Bilder zu synchronisieren, um einen genauen Vergleich zu ermöglichen.
- Speichern Sie die Bilder mit ihren angepassten Maßstäben.
3. Fluoreszenzmessung in Stuhlproben und Plasma
- Sammeln Sie 4 Stunden nach der Sonde ein Kotpellet von jeder Maus in einem sterilen Röhrchen. Bewahren Sie die Röhren im Dunkeln auf Eis auf.
- Anästhesie der Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 240 mg/ml Pentobarbital-Natrium (Verdünnung, 1:100; siehe Materialtabelle). In einer Dosis von 0,03 ml / g Körpergewicht verabreichen.
- Blutproben von mindestens 700 μl werden in einem Röhrchen entnommen, das für die Plasmaentnahme mit Heparin oder EDTA ausgelegt ist, um die Gerinnung zu verhindern (siehe Materialtabelle), indem ein Glaskapillarröhrchen in den Plexus retroorbitalis14 eingeführt wird.
HINWEIS: Alternative Methoden zur Blutentnahme sind Herzpunktion oder Rückzug aus der Schwanzvene. Da es sich um ein terminales Verfahren handelt, müssen die Mäuse durch eine Zervixluxation oder eine alternative humane Methode eingeschläfert werden. Befolgen Sie die Empfehlungen der örtlichen Tierethikkommission für Euthanasie.
- Blutproben von mindestens 700 μl werden in einem Röhrchen entnommen, das für die Plasmaentnahme mit Heparin oder EDTA ausgelegt ist, um die Gerinnung zu verhindern (siehe Materialtabelle), indem ein Glaskapillarröhrchen in den Plexus retroorbitalis14 eingeführt wird.
- Zentrifugieren Sie die Blutproben bei 9.390 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Übertragen Sie das Plasma in ein neues steriles Röhrchen und bewahren Sie es im Dunkeln auf Eis auf.
- Verdünnen Sie 50 mg Stuhlproben in 200 μl 1x PBS und verdünnen Sie das Plasma 1:2 mit 1x PBS. Das Verdünnungsverhältnis kann basierend auf der Intensität des Fluoreszenzsignals geändert werden.
- Erzeugen Sie eine Standardkurve mit seriellen Verdünnungen von FITC-Dextran in 1x PBS. Beginnend mit der höchsten Konzentration von 20 mg·ml−1 FITC-Dextran nacheinander 7-10 mal um den Faktor 1:1 verdünnen.
ANMERKUNG: Die Konzentrationen müssen daher 20 mg·mL−1, 10 mg·mL−1, 5 mg·mL−1, 2,5 mg·mL−1, 1,25 mg·mL−1, 0,625 mg·mL−1, 0,3125 mg·mL−1 usw. betragen. - Platte 100 μL Proben und Standards in einer undurchsichtigen schwarzen 96-Well-Platte. Fügen Sie ein PBS-Leerzeichen hinzu. Lesen Sie die Fluoreszenz auf einem Fluoreszenzplatten-Reader (siehe Materialtabelle) mit der Absorption bei 530 nm und der Anregung bei 485 nm ab.
HINWEIS: Die Proben und Standards können doppelt oder dreifach plattiert werden, und dann werden ihre Fluoreszenzwerte gemittelt. - Bestimmen Sie die Konzentration von FITC-Dextran pro Probe, indem Sie die Fluoreszenz mit den bekannten Konzentrationen der Standardkurve vergleichen. In den Proben wird die Konzentration mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert (Schritt 3.5).
Representative Results
Die Analyse der In-vivo-Fluoreszenz zeigte, dass Mäuse, die nur die Kontrolldiät erhielten, eine höhere Leberaufnahme von FITC-Dextran und höhere Restfluoreszenzwerte in der Bauchhöhle aufwiesen als die Mäuse, die die mit Inulin ergänzte Diät erhielten (Abbildung 2A). Eine gewisse Fluoreszenz war im Blinddarm der Mäuse sichtbar, die die Inulin-Diät erhielten, aber es gab wenig bis gar keine Leberaufnahme, was darauf hindeutet, dass diese Diäten vor einer erhöhten Darmpermeabilität schützten.
Die Fluoreszenzwerte in Plasma- und Stuhlproben verstärken und quantifizieren ihre In-vivo-Gegenstücke . Die Mäuse, die die mit Inulin ergänzte Diät erhielten, hatten signifikant niedrigere FITC-Dextran-Spiegel in ihrem Plasma im Vergleich zu den Mäusen, die nur die Kontrolldiät erhielten (Abbildung 2B). Dies deutet darauf hin, dass sie eine verbesserte Darmbarrierefunktion hatten, da weniger FITC-Dextran die Darmbarriere in den Kreislauf durchdringen konnte. Übereinstimmend hatten die Mäuse, die die Inulin-Diät erhielten, signifikant höhere Konzentrationen von FITC-Dextran in ihrem Kot als die Mäuse, die nur die Kontrolldiät erhielten (Abbildung 2C). Dies bestätigt, dass sie eine intakte Darmbarrierefunktion hatten, da das FITC-Dextran bis zur Ausscheidung im Dickdarm verblieb, wie es als normal angesehen wird. Die niedrigeren Konzentrationen von FITC-Dextran im Kot der Kontrollmäuse deuten darauf hin, dass es durch die Darmbarriere in den Kreislauf gelangt ist, anstatt angemessen ausgeschieden zu werden. Die hohen Konzentrationen von FITC-Dextran im Plasma verstärken diesen Befund.
Abbildung 2: Eine Nahrungsergänzung mit Inulin verringert die Translokation von FITC-Dextran durch die Darmbarriere. (A) Die Restfluoreszenz und hepatische Aufnahme von FITC-Dextran. Rot = höchste Intensität; dunkelviolett = niedrigste Intensität. Maximale Fluoreszenz von 2,15 x 103, minimale Fluoreszenz von 0,378. (B) Die plasmatische Konzentration von FITC-Dextran. P = 0,010. (C) Die Stuhlkonzentration von FITC-Dextran. P = 0,00003. N = 4 pro Gruppe. Die Daten werden als Mittelwert ± REM dargestellt. Jeder Punkt steht für eine Maus. Ungepaarter Schüler-t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Discussion
Die Darmbarrierefunktion ist ein integraler Bestandteil vieler verschiedener Krankheitsprozesse. Daher ist die Beurteilung der Darmpermeabilität auf nicht-invasive, kostengünstige und quantifizierbare Weise unerlässlich, um diese Krankheiten in Tiermodellen genau darzustellen. Der FITC-Dextran-Assay bietet die Möglichkeit für diese Darstellung. Dieses Protokoll umfasst jedoch mehrere kritische Schritte, die genau ausgeführt werden müssen, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Erstens ist es wichtig, die Verwendung von FITC-Dextran in geeigneter Größe sicherzustellen. Für die Untersuchung der In-vivo-Permeabilität ist 4 kDa FITC-Dextran das optimale Molekulargewicht, und mit zunehmendem Molekulargewicht nimmt die Permeabilität ab15. Daher kann die Verwendung von FITC-Dextran mit einem anderen Molekulargewicht zu verwirrenden oder unzuverlässigen Ergebnissen führen. Darüber hinaus ist es wichtig, die Zeit jeder Sonde zu notieren und die Zeitpunkte für die In-vivo-Datenerfassung und die Sammlung von Plasma und Kot entsprechend anzupassen. Wenn zum Beispiel zwei Mäuse im Abstand von 10 Minuten behandelt werden, müssen die In-vivo-Fluoreszenzmesswerte und die Sammlung von Kot und Plasma ebenfalls im Abstand von 10 Minuten erfolgen. Der Vergleich der Fluoreszenz zu den gleichen Zeitpunkten ermöglicht eine genauere Darstellung der Unterschiede in der Permeabilität. Darüber hinaus sollte die Reihenfolge, in der die Tiere aus verschiedenen Gruppen getestet werden, abgewechselt werden, um einen zeitlichen Clustereffekt zu vermeiden. Anstatt zuerst alle Tiere der Gruppe A und dann alle Tiere der Gruppe B (AAABBB) zu testen, wird empfohlen, die Gruppe nach jedem Tier (ABABAB) zu wechseln.
Dieser Assay kann so modifiziert werden, dass er nur die Auswertung von Plasma- und Stuhlproben umfasst, wenn kein Zugang zu einem Bildgebungsgerät besteht. Obwohl die direkte Fluoreszenzbildgebung in vivo die Visualisierung der Leberaufnahme und der verbleibenden abdominalen Fluoreszenz ermöglicht, liefert die Auswertung der Fluoreszenz in den Plasma- und Kotproben immer noch eine quantitative Messung der Darmpermeabilität. Darüber hinaus korrelieren, wie das beschriebene Experiment zeigt, die Fluoreszenzwerte im Plasma und im Kot gut mit der In-vivo-Bildgebung . Darüber hinaus kann dieser Assay so modifiziert werden, dass er nur die In-vivo-Bildgebung umfasst. Auf diese Weise können die Tiere am Leben erhalten werden, um andere Parameter weiter zu testen oder zu überwachen, wie sich die Darmpermeabilität im Laufe der Zeit verändert. Die Möglichkeit, diesen Assay zu modifizieren, macht ihn daher zugänglich und dennoch quantitativ. Schließlich wurde die Dosierung von 200 μl 80 mg·ml−1 FITC-Dextran, die jeder Maus verabreicht wurde, zuvor verwendet und hat sich bei Mäusen mit geringen Unterschieden im Körpergewicht als wirksam erwiesen16. Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, dass alle Mäuse, die im Abschnitt über die repräsentativen Ergebnisse verwendet wurden, ungefähr 20 g wogen, so dass für jede Maus die gleiche Dosierung verwendet werden konnte. Um Unterschiede im Körpergewicht auszugleichen, kann FITC-Dextran jedoch in einer Dosierung von 0,6-0,8 mg/g Körpergewicht verabreicht werden, z. B.17. Unabhängig von der verwendeten Dosierung ist es wichtig, die Menge, die jeder Maus verabreicht wird, auf weniger als 10 ml·kg−1 zu begrenzen, um Komplikationen oder Beschwerden zu vermeiden18.
Obwohl der FITC-Dextran-Assay eine effektive Methode zur Bewertung der Darmbarrierefunktion bietet, weist er dennoch einige Einschränkungen auf. Eine Einschränkung dieses Modells besteht darin, dass die Mäuse mehrere Stunden lang gefastet werden müssen, was bedeutet, dass es unzuverlässig ist, diese Ergebnisse mit denen von Mäusen zu vergleichen, die nicht gefastet wurden. Darüber hinaus kann das Fasten die Ergebnisse in bestimmten Modellen beeinflussen, die strenge Fütterungspläne erfordern, z. B. bei der Messung des Blutzuckers in Tiermodellen für Diabetes.
Trotz dieser Einschränkungen bleibt der FITC-Dextran-Assay eine effektive Methode zur Analyse der Darmpermeabilität, da er quantitativ, vielseitig, kostengünstig und weniger invasiv ist als viele klassische Methoden. Gängige Sonden zur Messung der Darmpermeabilität sind beispielsweise kleine Saccharidsonden oder Cr-EDTA, die einige Vorteile haben19. Einige Saccharidsonden haben jedoch nur eine regionsspezifische Permeabilität. Da sie im distalen Teil des Dünndarms hydrolysiert werden, geben sie keinen Einblick in die Permeabilität des Dickdarms19. Auf der anderen Seite kann Cr-EDTA Informationen über die Dickdarmpermeabilität liefern, erfordert jedoch Messungen für 24 Stunden, wodurch der Zeitaufwand dieser Methode viel höher ist als der des FITC-Dextran-Assays20. Darüber hinaus bietet keine dieser Methoden die direkte In-vivo-Bildgebung dieses Assays. Daher bietet der FITC-Dextran-Assay eine relativ einfache, direkte und effektive Option im Vergleich zu alternativen Methoden zur Messung der Darmpermeabilität.
Schließlich ist bei Krankheitsprozessen wie IBDs4, Alzheimer21 und Lebererkrankung2 die intestinale Permeabilität ein wichtiger Parameter, der mit dem FITC-Dextran-Assay gemessen werden könnte, um Studien zu verbessern. Bei der Entwicklung neuartiger Behandlungen, wie z. B. Immuntherapien für IBDs, kann dieser Assay beispielsweise verwendet werden, um die Wirksamkeit des Therapeutikums zur Aufrechterhaltung der Integrität der Darmbarriere zu testen. In Anbetracht der Tatsache, dass eine beeinträchtigte Darmbarrierefunktion an der Aufrechterhaltung der chronischen Entzündung bei UC beteiligt sein kann, ist es beispielsweise wichtig zu untersuchen, wie gut ein Therapeutikum vor erhöhter Permeabilität schützt4. Dies ist nur ein Beispiel, aber der FITC-Dextran-Assay ist eine zugängliche und quantifizierbare Methode zur Messung der Darmpermeabilität in vielen verschiedenen Bereichen und Aspekten der Forschung.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Offenlegungen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada finanziert (Zuschuss RGPIN-2018-06442 an MMS). Wir danken der Tiereinrichtung im CRCHUM und Dr. Junzheng Peng von der Cardiovascular Phenotyping Platform.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ppm Fe Diet (10% Inulin) | Envigo Teklad | TD.190651 | Representative Results |
| 50 ppm Fe Diet (FeSO4) | Envigo Teklad | TD.190723 | Representative Results |
| BALB/c Mice 49-55 Days, Female | Charles River | 028BALB/C | Representative Results |
| BD 1 mL Syringe Tuberculin Slip Tip | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For gavage |
| BD Microtainer Tubes - With LH (Lithium Heparin) | Becton, Dickinson and Company | 365965 | For plasma collection |
| Centrifuge 5420 | Eppendorf | S420KN605698 | |
| Curved Gavage Needle (Gavage Cannula) 7.7.0 38 mm x 22 G | Harvard Apparatus Canada | 34-024 | No longer available - A potential alternative is available at Instech Labs (FTP-22-38) |
| Euthanyl (Pentobarbital Sodium) 240 mg/mL | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 141704 | 1/100 dilution; Administered via intraperitoneal injection at 0.03 mL/g body weight |
| FITC-dextran 4 | TdB Labs | 20550 | |
| Heparinized Capillary Tubes | Kimble Chase Life Science and Research | 2501 | For retro-orbital blood collection |
| Microplate, PS, 96-well, Flat-bottom (Chimney Well), Black, Flutrac, Med. Binding | Greiner Bio-one | 655076 | |
| MiniARCO Clipper Kit | Kent Scientific | CL8787-KIT | For hair removal |
| Optix MX2 and Optix Optiview | Advanced Research Technologies | 2.02.00.6 | Fluorescence imaging machine and software |
| Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Wisent Inc | 311-010-LL | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | Ophthalmic ointement to prevent eye damage during anesthesia |
| Spark Multiplate Reader | Tecan | 30086376 |
References
- König, J., et al. Human intestinal barrier function in health and disease. Clinical and Translational Gastroenterology. 7 (10), 196 (2016).
- Lorenzo-Zuniga, V., et al. Insulin-like growth factor I improves intestinal barrier function in cirrhotic rats. Gut. 55 (9), 1306-1312 (2006).
- Schwarz, B. T., et al. LIGHT signals directly to intestinal epithelia to cause barrier dysfunction via cytoskeletal and endocytic mechanisms. Gastroenterology. 132 (7), 2383-2394 (2007).
- Schmitz, H., et al. Altered tight junction structure contributes to the impaired epithelial barrier function in ulcerative colitis. Gastroenterology. 116 (2), 301-309 (1999).
- Fouts, D. E., Torralba, M., Nelson, K. E., Brenner, D. A., Schnabl, B. Bacterial translocation and changes in the intestinal microbiome in mouse models of liver disease. Journal of Hepatology. 56 (6), 1283-1292 (2012).
- Galipeau, H. J., Verdu, E. F. The complex task of measuring intestinal permeability in basic and clinical science. Neurogastroenterology and Motility. 28 (7), 957-965 (2016).
- Bordoni, L., et al. Positive effect of an electrolyzed reduced water on gut permeability, fecal microbiota and liver in an animal model of Parkinson's disease. PLoS One. 14 (10), 0223238 (2019).
- Wang, Q., Fang, C. H., Hasselgren, P. -O. Intestinal permeability is reduced and IL-10 levels are increased in septic IL-6 knockout mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 281 (3), 1013-1023 (2001).
- Crapser, J., et al. Ischemic stroke induces gut permeability and enhances bacterial translocation leading to sepsis in aged mice. Aging. 8 (5), 1049-1063 (2016).
- Mal Earley, Z., et al. Burn injury alters the intestinal microbiome and increases gut permeability and bacterial translocation. PLoS One. 10 (7), 0129996 (2015).
- Sharon, G., et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).
- Schroeder, B. O., et al. Bifidobacteria or fiber protects against diet-induced microbiota-mediated colonic mucus deterioration. Cell Host & Microbe. 23 (1), 27-40 (2018).
- Hajjar, R., et al. Improvement of colonic healing and surgical recovery with perioperative supplementation of inulin and galacto-oligosaccharides. Clinical Nutrition. 40 (6), 3842-3851 (2021).
- JoVE. Lab Animal Research. Blood Withdrawal I. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).
- Costantini, T. W., et al. Quantitative assessment of intestinal injury using a novel in vivo, near-infrared imaging technique. Molecular Imaging. 9 (1), 30-39 (2010).
- Thevaranjan, N., et al. Age-associated microbial dysbiosis promotes intestinal permeability, systemic inflammation, and macrophage dysfunction. Cell Host & Microbe. 21 (4), 455-466 (2017).
- Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 104, 1-14 (2014).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- Arrieta, M. C., Bistritz, L., Meddings, J. B.
- von Martels, J. Z. H., Bourgonje, A. R., Harmsen, H. J. M., Faber, K. N., Dijkstra, G. Assessing intestinal permeability in Crohn's disease patients using orally administered 52Cr-EDTA. PLoS One. 14 (2), 0211973 (2019).
- Gonzalez-Escamilla, G., Atienza, M., Garcia-Solis, D., Cantero, J. L. Cerebral and blood correlates of reduced functional connectivity in mild cognitive impairment. Brain Structure and Function. 221 (1), 631-645 (2016).
