I denne studien administreres fluorescein-isotiocyanatmerket (FITC) dextran til mus via oral gavage for å evaluere intestinal permeabilitet både in vivo og i plasma- og fekalprøver. Siden tarmbarrierefunksjonen påvirkes i mange sykdomsprosesser, kan denne direkte og kvantitative analysen brukes i ulike forskningsområder.
Tarmbarriereintegritet er et kjennetegn på tarmhelsen. Mens tarmbarrierens integritet kan vurderes ved hjelp av indirekte markører som måling av plasmainflammatoriske markører og bakteriell translokasjon til milten og lymfeknuter, kvantifiserer gullstandarden direkte utvalgte molekylers evne til å krysse tarmslimhinnelaget mot systemisk sirkulasjon. Denne artikkelen bruker en ikke-invasiv, kostnadseffektiv og lavbelastningsteknikk for å kvantifisere og følge i sanntid tarmpermeabiliteten hos mus ved bruk av fluorescein-isotiocyanatmerket dextran (FITC-dextran). Før oral tilskudd med FITC-dextran fastes musene. De blir deretter herjet med FITC-dextran fortynnet i fosfatbufret saltvann (PBS). En time etter gavage blir musene utsatt for generell anestesi ved bruk av isofluran, og in vivo-fluorescensen visualiseres i et bildekammer. Denne teknikken tar sikte på å vurdere gjenværende fluorescens i bukhulen og leveropptaket, noe som tyder på portalmigrasjon av den fluorescerende sonden. Blod- og avføringsprøver samles 4 timer etter oral gavage, og musene ofres. Plasma- og fekale prøver fortynnet i PBS blir deretter belagt, og fluorescensen registreres. Konsentrasjonen av FITC-dextran beregnes deretter ved hjelp av en standardkurve. I tidligere forskning har in vivo-avbildning vist at fluorescens raskt sprer seg til leveren hos mus med en svakere tarmbarriere indusert av et fiberfattig diett, mens hos mus supplert med fiber for å styrke tarmbarrieren, beholdes det fluorescerende signalet hovedsakelig i mage-tarmkanalen. I tillegg hadde kontrollmusene i denne studien forhøyet plasmafluorescens og redusert fluorescens i avføringen, mens omvendt hadde inulintilskudd mus høyere nivåer av fluorescenssignaler i tarmen og lave nivåer i plasma. Oppsummert gir denne protokollen kvalitative og kvantitative målinger av intestinal permeabilitet som markør for tarmhelse.
Tarmbarrieren spiller en viktig rolle i både helse og sykdom. Det krever en kompleks balanse mellom å la de nødvendige næringsstoffene trenge inn i sirkulasjonen fra tarmlumenet samtidig som det forhindrer penetrering av proinflammatoriske molekyler, som patogener eller antigener1. Økt permeabilitet kan skyldes mange gastrointestinale sykdommer, som leversykdom eller inflammatoriske tarmsykdommer (IBD)2,3. For eksempel, i ulcerøs kolitt (UC), en IBD, fører kronisk betennelse til nedbrytning av stramme veikryss, den påfølgende forstyrrelsen av tarmbarrieren og translokasjonen av bakterier, som potensielt opprettholder slimhinne og systemisk betennelse4.
Tarmbarrierens integritet er derfor en viktig markør for tarmhelsen. Imidlertid har dagens metoder for måling av intestinal permeabilitet mange begrensninger. For eksempel er metoder som måler plasmainflammatoriske markører eller bakteriell translokasjon til milt og lymfeknuter indirekte 5,6. Andre metoder kan være invasive og tidkrevende. Denne artikkelen beskriver en ikke-invasiv og kostnadseffektiv analyse som direkte og kvantitativt måler intestinal permeabilitet. Denne analysen bruker fluorescein-isotiocyanatmerket dextran (FITC-dextran) for å følge intestinal permeabilitet i sanntid ved å måle fluorescens in vivo. I tillegg kvantifiserer måling av FITC-dekstrannivået i plasma og avføring tarmpermeabiliteten (figur 1).
FITC-dextran permeabilitetsanalysen har tidligere blitt brukt i mange forskjellige sammenhenger, inkludert i dyremodeller av Parkinsons sykdom7, sepsis8, iskemisk slag9 og brannskade10. I tillegg har denne analysen nylig blitt brukt til å hjelpe til med å forstå hvordan tarmmikrobiomet kan være involvert i forskjellige sykdomsprosesser og hvordan det kan målrettes eller manipuleres som en potensiell terapeutisk. For eksempel har den blitt brukt til å studere mikrobiomet og mikrobiombaserte terapier i aldring 11, IBD12, kolorektal kreft13 og autismespektrumforstyrrelse11. Siden tarmbarrierefunksjonen er involvert i mange aspekter av helse og sykdom, har denne analysen blitt brukt mye. Dens relative enkelhet og lave tidsbelastning gjør den ideell for testing av in vivo-forholdene som mistenkes å endre tarmbarrierens integritet. Dens kvantitative resultater er nyttige for å bestemme effektiviteten av en potensiell behandling.
I denne studien ble effekten av diett på tarmbarrierefunksjonen evaluert ved hjelp av FITC-dextran-analysen. Den intestinale permeabiliteten hos mus som fikk en kontrolldiett og tarmpermeabiliteten hos mus som fikk en inulin-supplert diett ble sammenlignet. Inulin er et gunstig oligosakkarid som har vist seg å forbedre tarmbarrierefunksjonen12,13. For in vivo fluorescensmålinger (bakgrunn) ble ytterligere en ubehandlet mus brukt som negativ kontroll og fikk PBS i stedet for FITC-dextran. Dette eksperimentet viser at FITC-dextran-analysen er et verdifullt verktøy for å evaluere intestinal permeabilitet.
Tarmbarrierefunksjonen er en integrert del av mange forskjellige sykdomsprosesser. Derfor er vurdering av intestinal permeabilitet på en ikke-invasiv, kostnadseffektiv og kvantifiserbar måte avgjørende for nøyaktig å representere disse sykdommene i dyremodeller. FITC-dextran-analysen gir mulighet for denne representasjonen. Denne protokollen innebærer imidlertid flere kritiske trinn som må fullføres nøyaktig for å oppnå pålitelige resultater. For det første er det viktig å sikre bruk av passende størrelse FITC-dekstran. For undersøkelse in vivo permeabilitet er 4 kDa FITC-dextran den optimale molekylvekten, og når molekylvekten øker, reduseres permeabiliteten15. Dermed kan bruk av FITC-dextran med en annen molekylvekt gi forvirrende eller upålitelige resultater. I tillegg er det viktig å notere tidspunktet for hver gavage og å justere tidspunktene for in vivo datainnsamling og innsamling av plasma og avføring tilsvarende. For eksempel, hvis to mus er herjet 10 min fra hverandre, må in vivo fluorescensavlesninger og innsamling av avføring og plasma også forekomme med 10 minutters mellomrom. Sammenligning av fluorescensen på samme tidspunkter muliggjør en mer nøyaktig representasjon av forskjellene i permeabilitet. Videre bør rekkefølgen dyrene fra forskjellige grupper testes i skiftes for å forhindre en klyngeeffekt på grunn av timing. I stedet for å teste alle dyrene i gruppe A først, deretter alle dyrene i gruppe B nummer to (AAABBB), anbefales det at gruppen byttes etter hvert dyr (ABABAB).
Denne analysen kan modifiseres for å inkludere bare evaluering av plasma- og fekale prøver hvis det mangler tilgang til en bildebehandlingsmaskin. Selv om direkte fluorescensavbildning in vivo tillater visualisering av leverinntak og gjenværende abdominal fluorescens, gir evaluering av fluorescens i plasma og fekale prøver fortsatt en kvantitativ måling av intestinal permeabilitet. Videre, som demonstrert ved det beskrevne eksperimentet, korrelerer fluorescensnivåene i plasma og avføring godt med in vivo-avbildningen. I tillegg kan denne analysen endres slik at den bare inkluderer in vivo-avbildning. Dette gjør at dyrene kan holdes i live for å fortsette å teste andre parametere eller overvåke hvordan intestinal permeabilitet endres over tid. Evnen til å endre denne analysen gjør den derfor tilgjengelig, men likevel kvantitativ. Endelig har dosen på 200 μL av 80 mg · ml – 1 FITC-dextran gitt til hver mus blitt brukt tidligere og ble vist å være effektiv hos mus med små forskjeller i kroppsvekt16. Videre er det viktig å merke seg at alle musene som ble brukt i den representative resultatdelen veide ca. 20 g, slik at samme dosering kunne brukes for hver mus. For å ta hensyn til forskjeller i kroppsvekt kan imidlertid FITC-dextran administreres i en dose på 0,6-0,8 mg / g kroppsvekt, for eksempel17. Avgjørende, uavhengig av doseringen som brukes, er det viktig å begrense mengden til hver mus til mindre enn 10 ml · kg -1 for å forhindre komplikasjoner eller ubehag18.
Selv om FITC-dextran-analysen gir en effektiv metode for å evaluere tarmbarrierefunksjonen, har den fortsatt noen begrensninger. En begrensning av denne modellen er at den krever faste musene i flere timer, noe som betyr at det er upålitelig å sammenligne disse resultatene med de fra mus som ikke har blitt fastet. I tillegg kan faste påvirke resultatene i visse modeller som krever strenge fôringsplaner, for eksempel ved måling av blodsukker i dyremodeller for diabetes.
Til tross for disse begrensningene forblir FITC-dextran-analysen en effektiv metode for å analysere intestinal permeabilitet, da den er kvantitativ, allsidig, kostnadseffektiv og mindre invasiv enn mange klassiske metoder. For eksempel er vanlige sonder som brukes til å måle intestinal permeabilitet små sakkaridprober eller Cr-EDTA, som har noen fordeler19. Noen sakkaridprober har imidlertid bare regionspesifikk permeabilitet. Siden de hydrolyseres i den distale delen av tynntarmen, gir de ingen innsikt i kolonpermeabilitet19. På den annen side kan Cr-EDTA gi informasjon om kolonpermeabilitet, men krever målinger i 24 timer, noe som gjør tidsbelastningen for denne metoden mye høyere enn for FITC-dextran-analysen20. Videre gir ingen av disse metodene direkte in vivo avbildning av denne analysen. Derfor gir FITC-dextran-analysen et relativt enkelt, direkte og effektivt alternativ sammenlignet med alternative metoder for måling av intestinal permeabilitet.
Til slutt, i sykdomsprosesser som IBD4, Alzheimers sykdom21 og leversykdom2, er intestinal permeabilitet en viktig parameter som kan måles ved hjelp av FITC-dextran-analysen for å forbedre studier. For eksempel, ved utvikling av nye behandlinger, for eksempel immunterapier for IBD, kan denne analysen brukes til å teste effekten av terapeutisk for å opprettholde tarmbarriereintegritet. Tatt i betraktning at nedsatt tarmbarrierefunksjon kan være involvert i å opprettholde kronisk betennelse i UC, for eksempel, er det viktig å undersøke hvor godt en terapeutisk beskytter mot økt permeabilitet4. Dette er bare ett eksempel, men FITC-dextran-analysen er en tilgjengelig og kvantifiserbar måte å måle intestinal permeabilitet på mange forskjellige områder og aspekter av forskning.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av et tilskudd fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (stipend RGPIN-2018-06442 til MMS). Vi takker dyreavdelingen ved CRCHUM og Dr. Junzheng Peng fra Cardiovascular Phenotyping Platform.
50 ppm Fe Diet (10% Inulin) | Envigo Teklad | TD.190651 | Representative Results |
50 ppm Fe Diet (FeSO4) | Envigo Teklad | TD.190723 | Representative Results |
BALB/c Mice 49-55 Days, Female | Charles River | 028BALB/C | Representative Results |
BD 1 mL Syringe Tuberculin Slip Tip | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For gavage |
BD Microtainer Tubes – With LH (Lithium Heparin) | Becton, Dickinson and Company | 365965 | For plasma collection |
Centrifuge 5420 | Eppendorf | S420KN605698 | |
Curved Gavage Needle (Gavage Cannula) 7.7.0 38 mm x 22 G | Harvard Apparatus Canada | 34-024 | No longer available – A potential alternative is available at Instech Labs (FTP-22-38) |
Euthanyl (Pentobarbital Sodium) 240 mg/mL | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 141704 | 1/100 dilution; Administered via intraperitoneal injection at 0.03 mL/g body weight |
FITC-dextran 4 | TdB Labs | 20550 | |
Heparinized Capillary Tubes | Kimble Chase Life Science and Research | 2501 | For retro-orbital blood collection |
Microplate, PS, 96-well, Flat-bottom (Chimney Well), Black, Flutrac, Med. Binding | Greiner Bio-one | 655076 | |
MiniARCO Clipper Kit | Kent Scientific | CL8787-KIT | For hair removal |
Optix MX2 and Optix Optiview | Advanced Research Technologies | 2.02.00.6 | Fluorescence imaging machine and software |
Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Wisent Inc | 311-010-LL | |
Puralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | Ophthalmic ointement to prevent eye damage during anesthesia |
Spark Multiplate Reader | Tecan | 30086376 |