यह प्रोटोकॉल मानव प्लुरिपोटेंट और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से स्व-व्यवस्थित रक्त वाहिकाओं की पीढ़ी का वर्णन करता है। ये रक्त वाहिका नेटवर्क पेरिसाइट, चिकनी मांसपेशी एक्टिन और एक निरंतर तहखाने झिल्ली से घिरे एक व्यापक और जुड़े एंडोथेलियल नेटवर्क का प्रदर्शन करते हैं।
एक ऑर्गनॉइड को एक इंजीनियर बहुकोशिकीय इन विट्रो ऊतक के रूप में परिभाषित किया गया है जो विवो अंग में इसके अनुरूप नकल करता है जैसे कि इसका उपयोग ऊतक संस्कृति डिश में उस अंग के परिभाषित पहलुओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) -व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड अनुसंधान की चौड़ाई और अनुप्रयोग मस्तिष्क, रेटिना, आंसू वाहिनी, हृदय, फेफड़े, आंत, अग्न्याशय, गुर्दे और रक्त वाहिकाओं को शामिल करने के लिए काफी उन्नत हुए हैं। मानव माइक्रोवाइल की पीढ़ी के लिए तरीकों के विकास, विशेष रूप से, विट्रो में मानव रक्त वाहिका विकास और बीमारी के मॉडलिंग और सार्स-सीओवी-2 सहित वायरस संक्रमण में नई दवाओं या ऊतक ट्रोपिज्म के परीक्षण और विश्लेषण के लिए रास्ता खोल दिया है। दृश्य मार्गदर्शन की कमी वाले जटिल और लंबे प्रोटोकॉल कई स्टेम सेल-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स की प्रजनन क्षमता में बाधा डालते हैं। इसके अतिरिक्त, ऑर्गेनॉइड गठन प्रक्रियाओं और आत्म-संगठन की अंतर्निहित स्टोकेस्टिकिटी सेल भाग्य अधिग्रहण और प्रोग्रामिंग की समझ को आगे बढ़ाने के लिए ऑप्टिकल प्रोटोकॉल की पीढ़ी की आवश्यकता होती है। यहां, एचपीएससी से इंजीनियर 3 डी मानव रक्त वाहिका ऑर्गेनोइड्स (बीवीओ) की पीढ़ी के लिए एक नेत्रहीन निर्देशित प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। भित्ति कोशिकाओं के साथ एक निरंतर तहखाने की झिल्ली, संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं और संगठित अभिव्यक्ति प्रस्तुत करते हुए, बीवीओ मानव माइक्रोवास्कुलर की कार्यात्मक, रूपात्मक और आणविक विशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं। बीवीओ गठन कुल गठन के माध्यम से शुरू किया जाता है, इसके बाद मेसोडर्म और संवहनी प्रेरण। संवहनी परिपक्वता और नेटवर्क गठन को 3 डी कोलेजन और घुलनशील तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में समुच्चय एम्बेड करके शुरू और समर्थित किया जाता है। मानव पोत नेटवर्क 2-3 सप्ताह के भीतर बनते हैं और स्केलेबल कल्चर सिस्टम में आगे उगाए जा सकते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, बीवीओ को अंतर्जात माउस परिसंचरण के साथ इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड चूहों एनास्टोमोस में प्रत्यारोपित किया जाता है और कार्यात्मक धमनियों, नसों और धमनी में निर्दिष्ट किया जाता है। वर्तमान नेत्रहीन निर्देशित प्रोटोकॉल मानव ऑर्गनॉइड अनुसंधान को आगे बढ़ाएगा, विशेष रूप से सामान्य विकास, ऊतक वैस्कुलराइजेशन और बीमारी में रक्त वाहिकाओं के संबंध में।
संवहनी शिथिलता और रक्त वाहिका रोग अंग कार्यों में चिह्नित जटिलताओं के साथ मौजूद हैं। कार्डियोवैस्कुलर बीमारी (सीवीडी) दुनिया भर में मृत्यु का प्रमुख कारण है1 और संयुक्त राज्य अमेरिका में स्वास्थ्य देखभाल लागत बढ़ाने के लिए प्राथमिक योगदान कारक भी है। सीवीडी मामलों की संख्या सालाना बढ़ रही है, और इन मामलों की बढ़ती संख्या युवा आयु समूहों (20-45 वर्ष) में हो रही है। रक्त वाहिकाओं, संवहनी रोग और एंडोथेलियल डिसफंक्शन 3,4 के विकास और परिपक्वता का पता लगाने के लिए कई इन विवो मॉडल विकसित किए गए हैं। वर्तमान में, एकल और कई वंश-परिभाषित कोशिकाओं के संयोजन के तरीके या तो स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त होते हैं या विवो में वयस्क ऊतकों से अलग होते हैं, संवहनी नेटवर्क बना सकते हैं जो मानव संवहनी कार्य और शरीर रचना विज्ञान 5,6 के पहलुओं को दोहराते हैं। रक्त वाहिकाएं मेसोडर्म से विकास के दौरान पहली कार्यात्मक प्रणालियों में से एक के रूप में उभरी हैं, और वे या तो “वास्कुलोजेनेसिस” नामक असेंबली की प्रक्रिया के माध्यम से या पहले से मौजूद वाहिकाओं से विस्तार और शाखाओं द्वारा व्यवस्थित होती हैं, जिसे “एंजियोजेनेसिस” कहा जाता है।
विकासात्मक जीव विज्ञान और स्व-निर्देशित असेंबली की शक्ति का लाभ उठाते हुए, विमर एट अल ने एचपीएससी से पहले स्व-व्यवस्थित 3 डी मानव रक्त वाहिका ऑर्गेनोइड्स की सूचना दी जो मानव माइक्रोवास्कुलचर8 की कार्यात्मक, रूपात्मक और आणविक विशेषताओं को प्रदर्शित करते हैं। मानव वाहिका9 के समान, ये एचबीवीओ उत्पन्न होते हैं और एक एंडोथेलियम, एक निरंतर तहखाने झिल्ली और आसपास की भित्ति कोशिकाओं 8,10 के साथ मौजूद होते हैं। एचबीवीओ को विवो में प्रत्यारोपित किया जा सकता है और अंतर्जात परिसंचरण के साथ एनास्टोमोस किया जा सकता है। वे विट्रो में परिपक्वता से भी गुजर सकते हैं और सार्स-सीओवी-211 जैसे वायरस संक्रमण में कार्डियोवैस्कुलर बीमारियों (यानी, मधुमेह) 8 या ऊतक ट्रोपिज्म के लिए मॉडल के रूप में काम कर सकते हैं। जबकि हमने पहले एक लिखित प्रोटोकॉल10 प्रकाशित किया था, इस अन्यथा जटिल तकनीक के लिए कोई वीडियो प्रोटोकॉल उपलब्ध नहीं है।
एक संक्षिप्त चरणबद्ध प्रगति के माध्यम से, एचबीवीओ गठन को समग्र गठन, डब्ल्यूएनटी एगोनिस्ट, चिरोन (CHIR99021), और हड्डी मॉर्फोजेनिक प्रोटीन – 4 (बीएमपी 4) 12,13 का उपयोग करके मेसोडर्म प्रेरण, संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर ए (वीईजीएफए) और फोर्सकोलिन (फोर्स) 12 के माध्यम से संवहनी प्रेरण, और कस्टम स्प्राउटिंग मैट्रिक्स 8,10 में एम्बेड करने के माध्यम से पूरा किया जाता है।. संवहनी परिपक्वता और नेटवर्क गठन अंकुरित मैट्रिक्स में समुच्चय के एम्बेडिंग का पालन करते हैं। ये मानव पोत नेटवर्क 2-3 सप्ताह के भीतर बनते हैं और उन्हें अंकुरित मैट्रिक्स से हटाया जा सकता है और आगे 6 महीने तक स्केलेबल कल्चर सिस्टम में उगाया जा सकता है। यहां, मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न वाहिका के गठन और आवेदन के लिए ऑप्टिकल रूप से निर्देशित प्रक्रियाएं प्रदान की जाती हैं।
स्टेम सेल-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों में हाल की सफलताओं ने मानव वाहिका के अधिक उन्नत और शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल के लिए रूपरेखा प्रदान की है। यहां प्रस्तुत मानव रक्त वाहिका ऑर्गेनॉइड (एचबीवीओ) मॉडल, हमारी प्रयोगशाला 8,10 में विकसित, न केवल मानव वास्कुलोजेनेसिस के आगे के पहलुओं की खोज का एक शक्तिशाली साधन प्रदान करता है, बल्कि रोग मॉडलिंग और पुनर्योजी चिकित्सा 8,10,11 के नए रास्ते भी प्रदान करता है। विवो मॉडल में कई को रक्त वाहिकाओं, संवहनी रोग और एंडोथेलियल डिसफंक्शन 3,4 के विकास और परिपक्वता का पता लगाने के लिए नियोजित किया गया है। अलग-अलग दृष्टिकोण एकल और कई वंश-परिभाषित कोशिकाओं को जोड़ते हैं जो या तो स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त होते हैं या विवो में वयस्क ऊतकों से अलग होते हैं ताकि प्रतिकृति मानव संवहनी नेटवर्क 5,6 बनाया जा सके। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल विकासात्मक जीव विज्ञान और आत्म-संगठन के सिद्धांत का लाभ उठाता है ताकि पहली बार बहु-कोशिका वंश मानव रक्त वाहिका नेटवर्क उत्पन्न किया जा सके, जिसे संक्षेप में, एकल एचपीएससी 8,10 से उत्पन्न किया जा सकता है।
प्रत्येक स्टेम सेल लाइन में एक अद्वितीय आनुवंशिक मेकअप होता है और इसकी सोर्सिंग, फ़ंक्शन और जवाबदेहीके मामले में दूसरों से भिन्न होता है। इसलिए, मानव रक्त वाहिका ऑर्गेनोइड्स (एचबीवीओ) के लिए प्रोटोकॉल विकसित और अनुकूलित किया गया था ताकि कई (>12) विभिन्न एचपीएससी लाइनों 8,10 के साथ एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल संगतता सुनिश्चित की जा सके। यहां वर्णित विधि 2 सप्ताह में एचपीएससी-व्युत्पन्न रक्त वाहिका ऑर्गेनोइड उत्पन्न करती है। हालांकि, मीडिया संरचना और या एचबीवीओ पीढ़ी में तकनीकों में परिवर्तन से अप्रभावी पोत नेटवर्क और ऑर्गेनॉइड पीढ़ी हो सकती है। अलग-अलग स्टेम सेल लाइनों की अलग-अलग प्रसार दर भी स्टेम सेल प्रयोगकी प्रजनन क्षमता को स्पष्ट रूप से प्रभावित करती है और इस प्रकार, ऑर्गेनॉइड संस्कृतियां। उदाहरण के लिए, बीवीओ उत्पन्न करने में, अधिक प्रोलिफेरेटिव कोशिकाएं या बड़े दिन 1 समुच्चय की उच्च संख्या स्वाभाविक रूप से विभिन्न चयापचय वातावरण और गैस और पोषक तत्व प्रसार मापदंडों के अधीन होती है। यह बदले में, विकास कारक जोखिम समय और क्षमता, भेदभाव और संवहनी प्राइमिंग की डिग्री को बदलता है, और, सबसे महत्वपूर्ण बात, कोलेजन 1 और घुलनशील तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में समुच्चय को एम्बेड करने पर पोत नेटवर्क बनाने की क्षमता।
ऑक्सीजन का निष्क्रिय प्रसार और बाहरी वातावरण से आवश्यक पोषक तत्वों का प्रशासन विट्रो16 में 3 डी ऑर्गेनोइड्स और ऊतक मोर्फोजेनेसिस के दीर्घकालिक सेल विकास के लिए आदर्श नहीं है। यद्यपि कई कारकों (यानी, ऊतक चयापचय दर, पोषक तत्व और गैस जैव उपलब्धता, एक स्थिर या गतिशील वातावरण) पर निर्भर करता है, इन विट्रो में सुसंस्कृत ऊतकों के लिए एक सामान्य 150 μmO2 और पोषक तत्व प्रसार सीमा स्थापित की गई है, यह देखते हुए कि, शारीरिक रूप से, मानव ऊतक 150 μm के भीतर जीवित कोशिकाओं की डोरियां मौजूदहैं। यद्यपि 70-200 μm की प्रभावी गैस और पोषक तत्व प्रसार दूरी भी प्रस्तावित की गई है18,19,20,21, निर्माण घनत्व, तापमान, पीएच और मीडिया संरचना प्रसार प्रभावकारिता को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करती है। दिन 6 एम्बेडिंग के बाद सतह क्षेत्र अनुकूलन और इंटीग्रिन-बीटा रिसेप्टर संचार के कारण, व्यास में 250-300 μm के समुच्चय व्यास में >500-600 μm की तुलना में बेहतर प्रदर्शन करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक पूर्ण पोत अंकुरण प्रक्रिया और न्यूनतम संघनित ऑर्गेनॉइड कोर होता है। इस प्रकार, कुल आकार महत्वपूर्ण है और प्रारंभिक बीजारोपण के दौरान उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं की संख्या और कुल गठन के लिए आवंटित समय दोनों से प्रभावित हो सकता है। माइक्रोवेल प्लेटें जो कुल आकार और संख्या22 पर नियंत्रण की अनुमति देती हैं, इस प्रोटोकॉल में अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 6-वेल प्लेटों के उपयोग के परिणामस्वरूप अन्यथा स्टोकेस्टिक एग्रीगेट फॉर्मेशन तकनीक का एक व्यवहार्य विकल्प हैं। एचबीवीओ प्रोटोकॉल के पहले 6 दिनों के दौरान समय और कुल आकार ों के प्रबंधन में स्थिरता, यदि नहीं, तो बोनाफाइड रक्त वाहिका ऑर्गेनोइड्स को सफलतापूर्वक विकसित करने के महत्वपूर्ण संकेतकों में से एक है।
दिन 1 (मेसोडर्म प्रेरण) और दिन 4 (संवहनी प्रेरण) पर मध्यम परिवर्तन समुच्चय के अवसादन के साथ संयोजन में पूरा किया जाना चाहिए। यद्यपि सेंट्रीफ्यूजेशन एक आकर्षक विकल्प है, लेकिन कमजोर रूप से इकट्ठे एग्गरेट पर लागू अतिरिक्त बल अवांछित क्लंपिंग, असेंबली और कतरन का कारण बन सकते हैं, जो प्रोटोकॉल के बाद के चरणों में भेदभाव, परिपक्वता और अंकुरण प्रभावकारिता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं। दिन 6 एम्बेडिंग प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर काम करना उचित ईसीएम पोलीमराइजेशन और परत गठन को संरक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण है। कुल एम्बेडिंग और स्प्राउटिंग प्रेरण के दौरान, ईसीएम को 4 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के तापमान और / या 7.4 के अलावा ईसीएम पीएच को उजागर करने से न केवल पोलीमराइजेशन दर और ईसीएम परत अखंडता प्रभावित होगी, बल्कि एम्बेडेड समुच्चय की अंकुरित दक्षता भी प्रभावित होगी। ईसीएम अंकुरित मैट्रिक्स की लोचदार प्रकृति 12-वेल कल्चर डिश से बाँझ काटने की सतह तक आसान अलगाव और परिवहन की अनुमति देती है। मैट्रिक्स से हटाए गए और अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 96-वेल प्लेटों में स्थानांतरित किए गए अलग-अलग ऑर्गेनोइड्स आसपास के शेष ईसीएम का उपभोग करेंगे और निरंतर तहखाने झिल्ली के साथ स्व-संगठित भित्ति सेल-लेपित एंडोथेलियल माइक्रोवाइल नेटवर्क को बनाए रखेंगे।
जबकि इस प्रस्ताव में शामिल नहीं किया गया है, मीडिया रचनाओं में परिवर्तन उन बीमारियों को दोहरा सकते हैं जो बदले में, एचबीवीओ 8,11 में पैथोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं को उकसाते हैं। एचबीवीओ प्रणाली का उपयोग करके रोग मॉडलिंग की सीमाएं प्रसिद्ध से बहुत दूर हैं, और यह निश्चित रूप से एक ऐसा क्षेत्र है जिसे अन्वेषण की आवश्यकता है। पहले से एवैस्कुलर ऑर्गनॉइड संरचनाओं23 के वैस्कुलराइजेशन में हमारे रक्त वाहिका ऑर्गनॉइड तकनीक का अनुप्रयोग भी महत्वपूर्ण प्रभाव और रुचि का है।
The authors have nothing to disclose.
हम महत्वपूर्ण इनपुट और चर्चा के लिए हमारी प्रयोगशालाओं के सभी सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। जेएमपी को टी वॉन जैस्ट्रो फाउंडेशन, एफडब्ल्यूएफ विट्गेन्स्टाइन पुरस्कार (जेड 271-बी 19), ऑस्ट्रियाई एकेडमी ऑफ साइंसेज, इनोवेटिव मेडिसिन इनिशिएटिव 2 संयुक्त उपक्रम (जेयू) अनुदान समझौते संख्या 101005026, लेडुक ट्रान्साटलांटिक नेटवर्क ऑफ एक्सीलेंस इन कार्डियोवैस्कुलर रिसर्च, एलन इंस्टीट्यूट डिस्टिंग्विश्ड इन्वेस्टिगेटर प्रोग्राम और कनाडा 150 रिसर्च चेयर ्स प्रोग्राम एफ 18-01336 के साथ-साथ कनाडाई इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ रिसर्च कोविड-19 अनुदान एफ20-02333 से फंडिंग मिली।
1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
2-Mercaptoethanol | Millipore | 60-24-2 | |
7.5% sodium bicarbonate | Gibco | 5080094 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | cell dissociation reagent |
Albumin fraction V (BSA) | AppliChem | A1391, 0100 | |
Alexa Fluor 488–anti-rabbit IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 711-546-152 |
Alexa Fluor 488–anti-sheep IgG | — | Life Technologies | A11015 |
Alexa Fluor 647–anti-goat IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 705-606-147 |
Automated cell counter | Invitrogen | Countess II | |
B27 supplement | Gibco | 12587010 | |
Biological safety cabinet | Faster | SafeFAST Premium 212 | |
BMP4 | Miltenyi BioTec | 130-111-165 | |
CD31 | Endothelial cell | DAKO | M0823 |
CD31 | Endothelial cell | R&D | AF806 |
Cellulose wipes | |||
Centrifuge | Heraeus | Multifuge 4 KR | |
CHIR99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure) | |||
CO2 incubator | New Brunswick | Galaxy 170S | |
Collagen type IV | Basement membrane | Millipore | AB769 |
Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives) | Leica | SP8 | |
Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue | Invitrogen | C10283 | |
Coverslips (22 x 50 mm) | |||
Cy3–anti-mouse IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 715-166-150 |
DAPI | Sigma | D9542 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
Dulbecco's Modefied Eagle's Medium (DMEM) | Sigma | D5648-10L | |
Eppendorf tubes | |||
Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Fetal Bovien Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
FGF2 | Miltenyi BioTec | 130-093-841 | |
Fine forceps | FST | 11254-20 | |
Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides | Fisher Scientific | 12-550-016 | |
Forskolin | Sigma | F3917 | |
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Fisher Scientific | A1413302 | |
Glutamax | Gibco | 35050061 | |
Ham's F12 | Gibco | 11765054 | |
Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC | Thermo Scientific | Heraguard | |
Inverted contrasting tissue culture microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
iSpacer | SunJinLab | IS009 | |
KnockOut DMEM/F12 | Gibco | 12660012 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
non-essential amino acids (NEAAs) | Gibco | 11140035 | |
Orbital shaker | |||
Parafilm | |||
Paraformaldehyde (4%) in PBS | Boston BioProducts | BM-155 | |
PDGFR-β | Pericyte | R&D | AF385 |
PDGFR-β | Pericyte | Cell Signaling | 3169S |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
pH indicator strips (6.5-10) | Mquant, Millipore | 109543 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Pipettes (P1000, P200 and P20) | Gilson, Integra Pipetboy | ||
Prime Surface-U 96-well plates | Sumilon | MS9096-U | |
PurCol | Advanced BioMatrix | 5005 | |
RapiClear CS gel | SunJinLab | RCCS005 | |
RapiClear CS mounting solution | SunJinLab | RCCS002 | |
Serological pipettes (5, 10 and 25 mL) | Falcon | 357529, 357530, 357515 | |
SMA | vSMC/Pericyte | Sigma | 2547 |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N) | Sigma | S2770 | |
Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel) | Corning | 356231 | |
Stainless steel micro spatula (rounded end) | Fisher Scientific | 21-401-5 | |
Stainless steel spoon (double-ended) | Fisher Scientific | BelArt H367290018 | |
Stemflex medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell culture medium |
StemPro-34 SFM | Gibco | 10639011 | flexible serum-free medium |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 μL) | Biozym, Surphob | VT0270, VT0250, VT0220 | |
Tissue culture–treated 12-well plates TC | BD Falcon | 353043 | |
Tissue culture–treated 6-well plates | Eppendorf | 30720113 | |
Triton X-100 | Sigma | 93420 | |
Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red | Thermo Scientific | 12605010 | mammalian cell dissociating enzyme |
Tween 20 | Sigma | P7949 | |
Ultra-low-attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
Water bath (37 °C) | Fisher Scientific | Isotemp 210 | |
Y-27632 | Calbiochem | 688000 |