Detta protokoll beskriver genereringen av självorganiserande blodkärl från humana pluripotenta och inducerade pluripotenta stamceller. Dessa blodkärlsnätverk uppvisar ett omfattande och anslutet endotelnätverk omgivet av pericyter, glatt muskelaktin och ett kontinuerligt basalmembran.
En organoid definieras som en konstruerad multicellulär in vitro-vävnad som efterliknar dess motsvarande in vivo-organ så att den kan användas för att studera definierade aspekter av det organet i en vävnadsodlingsrätt. Bredden och tillämpningen av mänsklig pluripotent stamcellsforskning (hPSC) -härledd organoidforskning har avancerat avsevärt för att inkludera hjärnan, näthinnan, tårkanalen, hjärtat, lungan, tarmen, bukspottkörteln, njuren och blodkärlen, bland flera andra vävnader. Utvecklingen av metoder för generering av mänskliga mikrokärl har specifikt öppnat vägen för modellering av humant blodkärlsutveckling och sjukdom in vitro och för testning och analys av nya läkemedel eller vävnadstropism vid virusinfektioner, inklusive SARS-CoV-2. Komplexa och långa protokoll som saknar visuell vägledning hindrar reproducerbarheten hos många stamcellshärledda organoider. Dessutom kräver den inneboende stokasticiteten hos organoidbildningsprocesser och självorganisation generering av optiska protokoll för att främja förståelsen av cellens ödesförvärv och programmering. Här presenteras ett visuellt styrt protokoll för generering av 3D-organoider (BVO) konstruerade från hPSC. Genom att presentera ett kontinuerligt basalmembran, vaskulära endotelceller och organiserad artikulation med väggceller, uppvisar BVOs de funktionella, morfologiska och molekylära egenskaperna hos human mikrovaskulatur. BVO-bildning initieras genom aggregatbildning, följt av mesoderm och vaskulär induktion. Vaskulär mognad och nätverksbildning initieras och stöds genom inbäddning av aggregat i en 3D-kollagen och solubiliserad basalmembranmatris. Mänskliga fartygsnätverk bildas inom 2-3 veckor och kan odlas ytterligare i skalbara kultursystem. Det är viktigt att BVOs transplanteras i immunkomprometterade mössanastomos med den endogena muscirkulationen och specificerar i funktionella artärer, vener och arterioler. Det nuvarande visuellt styrda protokollet kommer att främja mänsklig organoidforskning, särskilt i förhållande till blodkärl i normal utveckling, vävnadsvaskularisering och sjukdom.
Vaskulär dysfunktion och blodkärlssjukdomar uppvisar markerade komplikationer i organfunktioner. Kardiovaskulär sjukdom (CVD) är den ledande dödsorsaken över hela världen1 och är också den främsta bidragande faktorn till ökande sjukvårdskostnader i USA. Antalet CVD-fall ökar årligen, och ett ökande antal av dessa fall förekommer i yngre åldersgrupper (20–45 år)2. Flera in vivo-modeller har utvecklats för att utforska utveckling och mognad av blodkärl, kärlsjukdom och endoteldysfunktion 3,4. För närvarande kan metoder som kombinerar enstaka och multipla härstamningsdefinierade celler antingen härledda från stamceller eller isolerade från vuxna vävnader in vivo skapa vaskulära nätverk som replikerar aspekter av mänsklig vaskulär funktion och anatomi 5,6. Blodkärl har uppstått som ett av de första funktionella systemen under utvecklingen från mesodermen, och de organiserar antingen genom en monteringsprocess som kallas “vaskulogenes” eller genom expansion och förgrening från befintliga kärl, som kallas “angiogenes”7.
Genom att utnyttja kraften i utvecklingsbiologi och självstyrd montering rapporterade Wimmer et al. de första självorganiserande 3D-humana blodkärlsorganoiderna från hPSC som uppvisar de funktionella, morfologiska och molekylära egenskaperna hos human mikrovaskulatur8. I likhet med mänsklig vaskulatur9 genereras dessa hBVOs och presenteras med ett endotel, ett kontinuerligt basalmembran och omgivande väggceller 8,10. hBVOs kan transplanteras in vivo och anastomoseras med den endogena cirkulationen. De kan också genomgå mognad in vitro och fungera som modeller för hjärt-kärlsjukdomar (dvs. diabetes)8 eller vävnadstropism vid virusinfektioner som SARS-CoV-211. Medan vi tidigare publicerat ett skriftligt protokoll10 finns det inget tillgängligt videoprotokoll för denna annars komplexa teknik.
Genom en kortfattad stegvis progression uppnås hBVO-bildning genom aggregatbildning, mesoderminduktion med användning av en WNT-agonist, Chiron (CHIR99021) och benmorfogent protein – 4 (BMP4)12,13, vaskulär induktion via vaskulär endotelial tillväxtfaktor A (VEGFA) och Forskolin (Fors)12, och inbäddning i en anpassad groddmatris 8,10. Vaskulär mognad och nätverksbildning följer inbäddningen av aggregaten i spridningsmatrisen. Dessa mänskliga kärlnätverk bildas inom 2-3 veckor och kan avlägsnas från groddmatrisen och odlas vidare i skalbara odlingssystem i upp till 6 månader. Här tillhandahålls optiskt styrda procedurer för bildning och tillämpning av human stamcellshärledd vaskulatur.
De senaste genombrotten i stamcellshärledda organoidkulturer har gett ramverket för mer avancerade och fysiologiskt relevanta modeller av mänsklig vaskulatur. Den mänskliga blodkärlsorganoidmodellen (hBVO) som presenteras här, utvecklad i vårt laboratorium 8,10, ger ett kraftfullt sätt att utforska inte bara ytterligare aspekter av mänsklig vaskulogenes utan också nya vägar för sjukdomsmodellering och regenerativ terapi 8,10,11. Flera in vivo-modeller har använts för att utforska utveckling och mognad av blodkärl, kärlsjukdom och endoteldysfunktion 3,4. Olika tillvägagångssätt kombinerar enstaka och flera härstamningsdefinierade celler antingen härledda från stamceller eller isolerade från vuxna vävnader in vivo för att skapa replikativa humana vaskulära nätverk 5,6. Protokollet som presenteras här utnyttjar principen om utvecklingsbiologi och självorganisation för att ge det första mänskliga blodkärlsnätverket någonsin med flera celler som i huvudsak kan genereras från en enda hPSC 8,10.
Varje stamcellslinje har en unik genetisk sammansättning och skiljer sig från andra när det gäller dess källa, funktion och lyhördhet15. Därför utvecklades och optimerades protokollet för humana blodkärlsorganoider (hBVO) för att säkerställa en robust och reproducerbar protokollkompatibilitet med flera (>12) olika hPSC-linjer 8,10. Metoden som beskrivs här genererar hPSC-härledda blodkärlsorganoider under 2 veckor. Förändringar i mediesammansättningen och/eller teknikerna vid hBVO-generering kan dock leda till ineffektivt kärlnätverk och organoidgenerering. De varierande spridningshastigheterna för enskilda stamcellslinjer påverkar också markant reproducerbarheten av stamcellsexperiment15 och därmed organoidkulturer. Till exempel, vid generering av BVO: er, är mer proliferativa celler eller högre antal stora dag 1-aggregat i sig föremål för olika metaboliska miljöer och gas- och näringsdiffusionsparametrar. Detta förändrar i sin tur tillväxtfaktorns exponeringstider och effektivitet, graden av differentiering och vaskulär priming, och, viktigast av allt, förmågan att bilda kärlnätverk vid inbäddning av aggregaten i kollagen 1 och solubiliserad basalmembranmatris.
Den passiva diffusionen av syre och administrering av väsentliga näringsämnen från en yttre miljö är inte idealisk för långsiktig celltillväxt av 3D-organoider och vävnadsmorfogenes in vitro16. Även om det är beroende av flera faktorer (dvs. vävnadens metaboliska hastighet, biotillgängligheten av näringsämnen och gaser, en statisk eller dynamisk miljö) har ett allmänt gränsvärde på 150 μmO2 och näringsdiffusion fastställts för vävnader som odlas in vitro, med tanke på att mänskliga vävnader fysiologiskt uppvisar strängar av levande celler inom 150 μm från perfuserade blodkärl17. Även om effektiva gas- och näringsdiffusionsavstånd på 70-200 μm också har föreslagits18,19,20,21, påverkar konstruktionsdensiteten, temperaturen, pH och mediekompositionen signifikant diffusionseffektiviteten. På grund av ytoptimering och integrin-beta-receptorkommunikation efter inbäddning dag 6 presterar aggregat med en diameter på 250-300 μm bättre än de >500-600 μm i diameter, vilket resulterar i en komplett kärlspirningsprocess och en minimalt kondenserad organoidkärna. Således är den aggregerade storleken avgörande och kan påverkas av både antalet celler som används under den initiala sådden och den tid som tilldelats för aggregatbildning. Mikrobrunnsplattor som möjliggör kontroll över aggregatstorleken och nummer22 är ett livskraftigt alternativ till den annars stokastiska ballastbildningstekniken som härrör från användningen av 6-brunnsplattor med ultralåg fastsättning i detta protokoll. Konsekvens i timing och hantering av aggregatstorlekarna under de första 6 dagarna av hBVO-protokollet är en av, om inte den mest, avgörande indikatorn för att framgångsrikt utveckla bona fide blodkärlorganoider.
Medieförändringar dag 1 (mesoderminduktion) och dag 4 (vaskulär induktion) måste slutföras i kombination med sedimentering av aggregaten. Även om centrifugering är ett frestande alternativ, kan de ytterligare krafterna som appliceras på de svagt monterade aggeraten orsaka oönskad klumpning, montering och skjuvning, vilket negativt påverkar differentiering, mognad och spirande effektivitet i de senare stadierna av protokollet. Att arbeta på is under dag 6-inbäddningsprocessen är avgörande för att bevara korrekt ECM-polymerisation och skiktbildning. Under inbäddningen och spiringinduktionen kommer exponering av ECM för temperaturer över 4 ° C och / eller ett annat ECM-pH än 7,4 att påverka inte bara polymerisationshastigheterna och ECM-skiktets integritet utan också spridningseffektiviteten hos de inbäddade aggregaten. ECM-groddmatrisens elastiska natur möjliggör enkel lossning och transport från odlingsskålen med 12 brunnar till den sterila skärytan. Individuella organoider som avlägsnas från matrisen och överförs till 96-brunnsplattor med ultralåg infästning kommer att konsumera den återstående omgivande ECM och behålla självorganiserade väggcellsbelagda endotelmikrokärlnätverk med ett kontinuerligt källarmembran.
Även om det inte omfattas av detta förslag kan ändringar av mediekompositionerna replikera sjukdomar som i sin tur framkallar patologiska reaktioner i hBVO 8,11. Gränserna för sjukdomsmodellering med hBVO-systemet är långt ifrån kända, och detta är verkligen ett område som behöver utforskas. Tillämpningen av vår blodkärlsorganoidteknologi vid vaskularisering av tidigare avaskulära organoidkonstruktioner23 är också av betydande inverkan och intresse.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar alla medlemmar i våra laboratorier för kritiska synpunkter och diskussioner. JMP fick finansiering från T. von Zastrow-stiftelsen, FWF Wittgenstein-priset (Z 271-B19), den österrikiska vetenskapsakademin, det gemensamma företaget för innovativa läkemedel 2 (JU) enligt bidragsavtal nr 101005026, Leducq Transatlantic Networks of Excellence in Cardiovascular Research, Allen Institute Distinguished Investigator Program och Canada 150 Research Chairs Program F18-01336 samt Canadian Institutes of Health Research COVID-19-bidrag F20-02343 och F20-02015.
1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
2-Mercaptoethanol | Millipore | 60-24-2 | |
7.5% sodium bicarbonate | Gibco | 5080094 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | cell dissociation reagent |
Albumin fraction V (BSA) | AppliChem | A1391, 0100 | |
Alexa Fluor 488–anti-rabbit IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 711-546-152 |
Alexa Fluor 488–anti-sheep IgG | — | Life Technologies | A11015 |
Alexa Fluor 647–anti-goat IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 705-606-147 |
Automated cell counter | Invitrogen | Countess II | |
B27 supplement | Gibco | 12587010 | |
Biological safety cabinet | Faster | SafeFAST Premium 212 | |
BMP4 | Miltenyi BioTec | 130-111-165 | |
CD31 | Endothelial cell | DAKO | M0823 |
CD31 | Endothelial cell | R&D | AF806 |
Cellulose wipes | |||
Centrifuge | Heraeus | Multifuge 4 KR | |
CHIR99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure) | |||
CO2 incubator | New Brunswick | Galaxy 170S | |
Collagen type IV | Basement membrane | Millipore | AB769 |
Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives) | Leica | SP8 | |
Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue | Invitrogen | C10283 | |
Coverslips (22 x 50 mm) | |||
Cy3–anti-mouse IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 715-166-150 |
DAPI | Sigma | D9542 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
Dulbecco's Modefied Eagle's Medium (DMEM) | Sigma | D5648-10L | |
Eppendorf tubes | |||
Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Fetal Bovien Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
FGF2 | Miltenyi BioTec | 130-093-841 | |
Fine forceps | FST | 11254-20 | |
Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides | Fisher Scientific | 12-550-016 | |
Forskolin | Sigma | F3917 | |
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Fisher Scientific | A1413302 | |
Glutamax | Gibco | 35050061 | |
Ham's F12 | Gibco | 11765054 | |
Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC | Thermo Scientific | Heraguard | |
Inverted contrasting tissue culture microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
iSpacer | SunJinLab | IS009 | |
KnockOut DMEM/F12 | Gibco | 12660012 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
non-essential amino acids (NEAAs) | Gibco | 11140035 | |
Orbital shaker | |||
Parafilm | |||
Paraformaldehyde (4%) in PBS | Boston BioProducts | BM-155 | |
PDGFR-β | Pericyte | R&D | AF385 |
PDGFR-β | Pericyte | Cell Signaling | 3169S |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
pH indicator strips (6.5-10) | Mquant, Millipore | 109543 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Pipettes (P1000, P200 and P20) | Gilson, Integra Pipetboy | ||
Prime Surface-U 96-well plates | Sumilon | MS9096-U | |
PurCol | Advanced BioMatrix | 5005 | |
RapiClear CS gel | SunJinLab | RCCS005 | |
RapiClear CS mounting solution | SunJinLab | RCCS002 | |
Serological pipettes (5, 10 and 25 mL) | Falcon | 357529, 357530, 357515 | |
SMA | vSMC/Pericyte | Sigma | 2547 |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N) | Sigma | S2770 | |
Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel) | Corning | 356231 | |
Stainless steel micro spatula (rounded end) | Fisher Scientific | 21-401-5 | |
Stainless steel spoon (double-ended) | Fisher Scientific | BelArt H367290018 | |
Stemflex medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell culture medium |
StemPro-34 SFM | Gibco | 10639011 | flexible serum-free medium |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 μL) | Biozym, Surphob | VT0270, VT0250, VT0220 | |
Tissue culture–treated 12-well plates TC | BD Falcon | 353043 | |
Tissue culture–treated 6-well plates | Eppendorf | 30720113 | |
Triton X-100 | Sigma | 93420 | |
Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red | Thermo Scientific | 12605010 | mammalian cell dissociating enzyme |
Tween 20 | Sigma | P7949 | |
Ultra-low-attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
Water bath (37 °C) | Fisher Scientific | Isotemp 210 | |
Y-27632 | Calbiochem | 688000 |