घायल पीसी 12 कोशिकाओं के इलाज के लिए दो जड़ी बूटी संयोजन रणनीति की खोज
Summary
यह प्रोटोकॉल घायल पीसी 12 कोशिकाओं के इलाज के लिए दो जड़ी बूटियों की एक संयोजन रणनीति प्रदान करता है। प्रोटोकॉल पारंपरिक चीनी चिकित्सा (टीसीएम) के सर्वोत्तम अनुप्रयोग मोड को अनुकूलित करने के लिए एक संदर्भ प्रदान करता है।
Abstract
सेरेब्रल इस्किमिया के उपचार में पारंपरिक चीनी चिकित्सा (टीसीएम) के संयोजन के फायदों को देखते हुए, हमने घायल पीसी 12 कोशिकाओं के इलाज के लिए दो जड़ी बूटी संयोजन रणनीति का पता लगाने के लिए तैयारी संयोजन और घटक संयोजन के बीच प्रभावकारिता और तंत्र में अंतर का अध्ययन किया। कोबाल्ट क्लोराइड (CoCl2) को ग्लूकोज मुक्त माध्यम के साथ संयुक्त पीसी 12 कोशिकाओं के ऑक्सीडेटिव क्षति को प्रेरित करने के लिए नियोजित किया गया था। फिर, एस्ट्रागलस मोनगोलिकस (एएसटी) और एरिजेरोन ब्रेविसकैपस (एरी ) इंजेक्शन के इष्टतम संयोजन का चयन किया गया और पीसी 12 कोशिकाओं पर उनकी सुरक्षित और प्रभावी एकाग्रता की जांच के बाद समान डिजाइन विधियों का पालन किया गया। इसके अलावा, स्क्रीनिंग किए गए घटक संयोजन में दो जड़ी बूटियों में 10 μM एस्ट्रागलोसाइड A, 40 μM scutellarin और 75 μM क्लोरोजेनिक एसिड शामिल हैं। फिर, एमटीटी, एनेक्सीन वी-एफआईटीसी / पीआई, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण का उपयोग तैयारी संयोजन की प्रभावकारिता और तंत्र और घायल पीसी 12 कोशिकाओं पर घटक संयोजन का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। परिणामों से पता चला कि सेल प्रो-सर्वाइवल के लिए इष्टतम तैयारी संयोजन 6: 1.8 (μM) की एकाग्रता के साथ एस्ट इंजेक्शन और एरी कैप्सूल था। घटक संयोजन (10 μM एस्ट्रागलोसाइड A, 40 μM scutellarin, और 75 μM क्लोरोजेनिक एसिड) तैयारी संयोजन की तुलना में अधिक प्रभावी था। दोनों संयोजनों ने उल्लेखनीय रूप से एपोप्टोटिक दर, कैसपेज़ -3 की प्रतिदीप्ति तीव्रता और इंट्रासेल्युलर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) स्तर को कम कर दिया; इस बीच, उन्होंने पी-एकेटी / एकेटी, बीसीएल -2 / बैक्स और एनआरएफ 2 के अभिव्यक्ति स्तरों को विनियमित किया। घटक संयोजन में ये प्रभाव अधिक स्पष्ट थे। निष्कर्ष में, दोनों संयोजन पीसी12 कोशिकाओं पर ग्लूकोज मुक्त माध्यम के साथ संयुक्त सीओसीएल 2 द्वारा प्रेरित चोट को रोक सकते हैं, इस प्रकार सेल अस्तित्व को बढ़ावा देते हैं। हालांकि, तैयारी संयोजन पर घटक संयोजन की दक्षता ऑक्सीडेटिव तनाव और एपोप्टोसिस से संबंधित पीआई 3 के / एकेटी / एनआरएफ 2 सिग्नलिंग मार्ग के मजबूत विनियमन के कारण हो सकती है।
Introduction
क्रोनिक सेरेब्रल इस्किमिया, सेरेब्रल हाइपोपरफ्यूजन के कारण, मध्यम आयु वर्ग औरबुजुर्ग लोगों में एक आम बीमारी है। एक दीर्घकालिक मनोगत इस्किमिया रोग के रूप में, यह प्रगतिशील या लगातार न्यूरोलॉजिकल डिसफंक्शन का कारण बन सकता है। मुख्य रोग तंत्र में सेल एपोप्टोसिस और ऑक्सीडेटिव क्षति शामिल है, जिससे प्रगतिशील या लगातार न्यूरोलॉजिकल डिसफंक्शन होता है; यह अल्जाइमर रोग, संवहनी मनोभ्रंश और अन्य बीमारियों का पैथोलॉजिकल आधार है, और रोगियों के जीवन की गुणवत्ता को गंभीरता से प्रभावित करता है। हालांकि, क्रोनिक सेरेब्रल इस्किमिया2 के इलाज के लिए आधुनिक चिकित्सा में अभी भी आदर्श दवाओं की कमी है। इसी समय, पारंपरिक चीनी चिकित्सा (टीसीएम) 4 के नैदानिक अभ्यास में एस्ट्रागलस मोनगोलिकस (एएसटी) और एरिगेरोन ब्रेविसकैपस (एरी) के संयोजन का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। सेरेब्रल इस्किमिया के बाद तंत्रिका समारोह की वसूली को बढ़ावा देने में संयोजन रणनीति में उल्लेखनीय सुधार हुआ है, जो एक दवा की तुलना में बेहतर है; हालांकि,दो दवाओं के संयोजन में खुराक अनुपात में बड़े अंतर हैं। प्रभावी घटक और कार्रवाई के तंत्र को अच्छी तरह से परिभाषित नहीं किया गया है, जो इसके नैदानिक अनुप्रयोग को प्रतिबंधित करने वाला महत्वपूर्ण मुद्दा है।
पिछले अध्ययनों ने चूहों में सेरेब्रल इस्किमिया के इलाज में एस्ट इंजेक्शन और एरी इंजेक्शन के तैयारी संयोजन के सहक्रियात्मक प्रभाव का प्रदर्शन किया है। यह पी-एकेटी प्रोटीन की अभिव्यक्ति को बढ़ा सकता है और बीसीएल -2 संबद्ध मृत्यु प्रमोटर (बीएडी) प्रोटीन 5,6 की अभिव्यक्ति को डाउनरेगुलेट कर सकता है, जो बी-लिम्फोब्लास्टोमा 2 (बीसीएल -2) परिवार के प्रोटीन में से एक है और इसमें एपोप्टोसिस को बढ़ावा देने का प्रभाव है। हालांकि, इसके सहक्रियात्मक प्रभाव का भौतिक आधार और तंत्र स्पष्ट नहीं है। इसके अलावा, पीसी 12 कोशिकाओं के चोट मॉडल को सीओसीएल2 संयुक्त ग्लूकोज-मुक्त माध्यम के साथ स्थापित किया गया था, और एएसटी और एरी में इष्टतम घटक संयोजन की जांचऔर परिभाषित किया गया है।
इस अध्ययन में, घायल पीसी 12 सेल मॉडल का उपयोग करके एएसटी और एरी की प्रभावी खुराक की जांच की जाती है। सजातीय डिजाइन विधि के साथ संयुक्त इस मॉडल का उपयोग करके दो दवाओं के इष्टतम संयोजन की जांच की जाती है। सेल मॉडल का उपयोग तैयारी संयोजन और घायल पीसी 12 कोशिकाओं में घटक संयोजन के प्रभाव और तंत्र में अंतर का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। इस रणनीति का उद्देश्य सबसे अच्छा संयोजन मोड निर्धारित करने के लिए पीआई 3 के / एकेटी / एनआरएफ 2 सिग्नल मार्ग के माध्यम से घायल पीसी 12 कोशिकाओं पर दो प्रकार के संयोजनों के सुरक्षात्मक प्रभाव और नियामक तंत्र का पता लगाना है। यह अध्ययन टीसीएम के सर्वोत्तम अनुप्रयोग मोड को अनुकूलित करने के लिए एक संदर्भ प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
आधुनिक नैदानिक अभ्यास 2 में सेरेब्रल इस्किमिया के उपचार के लिए अभी भी आदर्श दवाओं की कमीहै। क्यूई को पूरक करने और रक्त परिसंचरण विधि को सक्रिय करने के मार्गदर्शन में, टीसीएम के नैदानिक अभ्यास …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को सिचुआन प्रांतीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग (2020वाईएफएस0325) की प्रमुख आर एंड डी परियोजनाओं द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 1300 series class II biosafety cabinet | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 1374 | |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
| ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, Inc | – | |
| Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | |
| Analytical flow cytometry | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Annexin V-FITC apoptosis detection kit | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
| Astragalus injection | Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company | A03190612144 | Ast injection |
| Astragaloside A | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 84687-43-4 | |
| Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 60267-1-Ig | |
| BCA protein quantification kit | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
| Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 26593-1-AP | |
| Carbon dioxide incubators | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 0816-2014 | |
| Caspase-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 19677-1-AP | |
| Chlorogenic acid | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 327-97-9 | |
| Cobalt chloride hexahydrate | Merck Biotechnology, Inc. | 7791-13-1 | CoCl2 |
| Dimethyl sulfoxide | Guangzhou saiguo biotech Company | 2020112701 | DMSO |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2020090101 | |
| DMEM high sugar medium | Thermo scientific Hyclone | 2110050 | |
| DMEM sugar free medium | Beijing Solarbio life sciences Company | 2029548 | |
| ECL luminous fluid | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Electrophoresis instrument | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
| Erigeron breviscapus capsule | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | Eri capsule |
| Fetal bovine serum | Four Seasons Institute of Biological Engineering | 20210402 | FBS |
| Fluorescent microscope | Olympms Corporation | IX71-F32PH | |
| Gel imager | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| Goat anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | – | |
| ImageJ 1.8.0 | National Institutes of Health, USA | – | imaging software |
| Immunol fluorescence staining kit | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
| KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
| Marker | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | |
| Microplate reader | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | HH35L2018296 | |
| Motic Inverted microscope | Nanda Scientific Instruments Co. | AE2000LED | |
| NaCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2014081301 | |
| Nonfat milk | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
| Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 16396-1-AP | |
| P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| PC12 cells | Chinese Academy of Sciences | CBP60430 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Thermo scientific Hyclone | SV30010 | |
| Phosphatase protease inhibitor mixture | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
| RI-PA lysis solution | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| SDS-PAGE sample loading buffer, 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| Sterile filter tips (0.22 µm) | Merck Biotechnology, Inc. | SLGP033RB | |
| Tris-base | Guangzhou saiguo biotech Company | 1115GR500 | TBS |
| Trypsin | Thermo scientific Hyclone | J190013 | |
| Tween-20 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021051301 | |
| Vortex oscillator | OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China | VXMNAL | |
| β-actin | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66009-1-Ig |
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