استكشاف استراتيجية الجمع بين الأعشاب لعلاج خلايا PC12 المصابة
Summary
يوفر هذا البروتوكول استراتيجية الجمع بين اثنين من الأعشاب لعلاج خلايا PC12 المصابة. يوفر البروتوكول مرجعا لتحسين أفضل طريقة تطبيق للطب الصيني التقليدي (TCM).
Abstract
في ضوء مزايا الجمع بين الطب الصيني التقليدي (TCM) في علاج نقص التروية الدماغية ، درسنا الاختلافات في الفعالية والآلية بين تركيبة التحضير ومجموعة المكونات من أجل استكشاف استراتيجية الجمع بين الأعشاب لعلاج خلايا PC12 المصابة. تم استخدام كلوريد الكوبالت (CoCl2) جنبا إلى جنب مع وسط خال من الجلوكوز للحث على الضرر التأكسدي لخلايا PC12. بعد ذلك ، تم اختيار المزيج الأمثل من حقن Astragalus mongholicus (Ast) وحقن Erigeron breviscapus (Eri) ودمجهما باتباع طرق تصميم موحدة بعد فحص تركيزهما الآمن والفعال على خلايا PC12. علاوة على ذلك ، تتكون تركيبة المكونات التي تم فحصها من 10 ميكرومتر أستراغالوسيد A ، و 40 ميكرومتر سكوتيلارين ، و 75 ميكرومتر حمض الكلوروجينيك في عشبين. بعد ذلك ، تم استخدام MTT و Annexin V-FITC / PI والتألق المناعي وتحليل اللطخة الغربية لتقييم فعالية وآلية تركيبة التحضير ومجموعة المكونات على خلايا PC12 المصابة. أظهرت النتائج أن تركيبة التحضير المثلى لبقاء الخلية كانت حقن Ast وكبسولة Eri بتركيز 6: 1.8 (ميكرومتر). كانت تركيبة المكونات (10 ميكرومتر أستراغالوسيد A ، 40 ميكرومتر سكوتيلارين ، و 75 ميكرومتر حمض الكلوروجينيك) أكثر فعالية من تركيبة التحضير. كلا المجموعتين خفضت بشكل ملحوظ معدل موت الخلايا المبرمج ، وكثافة مضان caspase-3 ، ومستوى أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS). وفي الوقت نفسه ، قاموا بتنظيم مستويات التعبير من p-Akt / Akt و Bcl-2 / Bax و Nrf2. كانت هذه التأثيرات أكثر وضوحا في تركيبة المكونات. في الختام ، يمكن لكلا المجموعتين أن تمنع الإصابة التي يسببها CoCl2 جنبا إلى جنب مع وسيط خال من الجلوكوز على خلايا PC12 ، وبالتالي تعزيز بقاء الخلية. ومع ذلك ، قد تكون كفاءة تركيبة المكونات على تركيبة التحضير بسبب تنظيمها الأقوى لمسار إشارات PI3K / Akt / Nrf2 المتعلق بالإجهاد التأكسدي وموت الخلايا المبرمج.
Introduction
نقص التروية الدماغية المزمن ، الناجم عن نقص التروية الدماغية ، هو مرض شائع في منتصف العمر وكبار السن1. كمرض إقفاري خفي طويل الأمد ، يمكن أن يؤدي إلى خلل وظيفي عصبي تدريجي أو مستمر. وتشمل الآليات المرضية الرئيسية موت الخلايا المبرمج والضرر التأكسدي ، مما يؤدي إلى خلل وظيفي عصبي تدريجي أو مستمر. هذا هو الأساس المرضي لمرض الزهايمر ، والخرف الوعائي ، وأمراض أخرى ، ويؤثر بشكل خطير على نوعية حياة المرضى. ومع ذلك ، لا يزال هناك نقص في الأدوية المثالية في الطب الحديث لعلاج نقص التروية الدماغية المزمن2. في الوقت نفسه ، تم استخدام مزيج من Astragalus mongholicus (Ast) و Erigeron breviscapus (Eri) على نطاق واسع في الممارسة السريرية للطب الصيني التقليدي (TCM)4. تحسنت استراتيجية الجمع بشكل ملحوظ في تعزيز استعادة وظيفة الأعصاب بعد نقص التروية الدماغية ، وهو أفضل من دواء واحد. ومع ذلك ، هناك اختلافات كبيرة في نسبة الجرعة في الجمع بين العقارين4. المكونات الفعالة وآلية العمل ليست محددة بشكل جيد ، وهي القضية الرئيسية التي تقيد تطبيقها السريري.
أظهرت الدراسات السابقة التأثير التآزري لمزيج التحضير لحقن Ast وحقن Eri في علاج نقص التروية الدماغية في الفئران. يمكن أن ينظم التعبير عن بروتين p-Akt ويقلل من تنظيم التعبير عن بروتين Bcl-2 المرتبط بالموت (BAD) 5,6 ، وهو أحد بروتينات عائلة B-lymphoblastoma 2 (Bcl-2) وله تأثير في تعزيز موت الخلايا المبرمج. ومع ذلك ، فإن الأساس المادي وآلية تأثيره التآزري غير واضحين. علاوة على ذلك ، تم إنشاء نموذج إصابة خلايا PC12 باستخدام CoCl2 مجتمعة وسط خال من الجلوكوز ، وتم فحص تركيبة المكونات المثلى في Ast و Eriوتعريفها 7.
في هذه الدراسة ، يتم فحص الجرعات الفعالة من Ast و Eri باستخدام نموذج خلية PC12 المصاب. يتم فحص المزيج الأمثل من العقارين باستخدام هذا النموذج جنبا إلى جنب مع طريقة التصميم المتجانسة. يستخدم نموذج الخلية لإجراء مزيد من التقييم للاختلاف في تأثيرات وآليات تركيبة التحضير ومجموعة المكونات في خلايا PC12 المصابة. تهدف هذه الاستراتيجية إلى استكشاف التأثير الوقائي والآلية التنظيمية لنوعي المجموعات على خلايا PC12 المصابة من خلال مسار إشارة PI3K / Akt / Nrf2 لتحديد أفضل وضع توليفة. توفر هذه الدراسة مرجعا لتحسين أفضل وضع تطبيق للطب الصيني التقليدي.
Protocol
Representative Results
Discussion
لا يزال هناك نقص في الأدوية المثالية لعلاج نقص التروية الدماغية في الممارسة السريرية الحديثة2. بتوجيه من تكملة qi وتفعيل طريقة الدورة الدموية ، تم استخدام Ast و Eri والمستحضرات الأخرى معا في الممارسة السريرية للطب الصيني التقليدي وحققت مزايا شاملة جيدة13،14<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من خلال مشاريع البحث والتطوير الرئيسية التابعة لإدارة العلوم والتكنولوجيا بمقاطعة سيتشوان (2020YFS0325).
Materials
| 1300 series class II biosafety cabinet | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 1374 | |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
| ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, Inc | – | |
| Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | |
| Analytical flow cytometry | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Annexin V-FITC apoptosis detection kit | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
| Astragalus injection | Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company | A03190612144 | Ast injection |
| Astragaloside A | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 84687-43-4 | |
| Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 60267-1-Ig | |
| BCA protein quantification kit | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
| Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 26593-1-AP | |
| Carbon dioxide incubators | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 0816-2014 | |
| Caspase-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 19677-1-AP | |
| Chlorogenic acid | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 327-97-9 | |
| Cobalt chloride hexahydrate | Merck Biotechnology, Inc. | 7791-13-1 | CoCl2 |
| Dimethyl sulfoxide | Guangzhou saiguo biotech Company | 2020112701 | DMSO |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2020090101 | |
| DMEM high sugar medium | Thermo scientific Hyclone | 2110050 | |
| DMEM sugar free medium | Beijing Solarbio life sciences Company | 2029548 | |
| ECL luminous fluid | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Electrophoresis instrument | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
| Erigeron breviscapus capsule | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | Eri capsule |
| Fetal bovine serum | Four Seasons Institute of Biological Engineering | 20210402 | FBS |
| Fluorescent microscope | Olympms Corporation | IX71-F32PH | |
| Gel imager | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| Goat anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | – | |
| ImageJ 1.8.0 | National Institutes of Health, USA | – | imaging software |
| Immunol fluorescence staining kit | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
| KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
| Marker | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | |
| Microplate reader | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | HH35L2018296 | |
| Motic Inverted microscope | Nanda Scientific Instruments Co. | AE2000LED | |
| NaCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2014081301 | |
| Nonfat milk | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
| Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 16396-1-AP | |
| P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| PC12 cells | Chinese Academy of Sciences | CBP60430 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Thermo scientific Hyclone | SV30010 | |
| Phosphatase protease inhibitor mixture | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
| RI-PA lysis solution | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| SDS-PAGE sample loading buffer, 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| Sterile filter tips (0.22 µm) | Merck Biotechnology, Inc. | SLGP033RB | |
| Tris-base | Guangzhou saiguo biotech Company | 1115GR500 | TBS |
| Trypsin | Thermo scientific Hyclone | J190013 | |
| Tween-20 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021051301 | |
| Vortex oscillator | OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China | VXMNAL | |
| β-actin | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66009-1-Ig |
References
- Mendelevich, E. G. Chronic cerebral ischemia, and dizziness. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).
- Gao, L. Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).
- Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection. Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).
- Bei, N., et al. Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke. Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).
- Tian, F., et al. Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method. China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).
- Li, J., et al. Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).
- Yan, Y., et al. Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).
- . Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69 (2020)
- . Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8 (2020)
- Liu, X., et al. N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation. International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).
- Fan, Y., et al. Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma. Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).
- Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. β-Asarone ameliorates β-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway. Frontiers in Pharmacology. 12, 659955 (2021).
- Li, J., Chen, H. Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine. Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).
- Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia. Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).
- Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).
- Wang, N., Sun, H., Ma, X. Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients. Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).
- Sun, Y. Q. Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats. Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).
- Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
- Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack. Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).
- Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice. Scientific Reports. 10 (1), 6164 (2020).
- El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis. Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619 (2019).
- Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury. Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).
- Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats). Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).
- Luca, M., Luca, A., Calandra, C. The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer’s disease and vascular dementia. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678 (2015).
- Wang, Z., et al. Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).
- Li, H., et al. Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways. Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).
- Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).
- Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617 (2021).
- Yin, L., et al. Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells. Molecules. 26 (10), 2983 (2021).
