Yaralı PC12 Hücrelerini Tedavi Etmek için İki Bitki Kombinasyonu Stratejisini Keşfetmek
Summary
Bu protokol, yaralı PC12 hücrelerini tedavi etmek için iki bitkinin bir kombinasyon stratejisini sağlar. Protokol, geleneksel Çin tıbbının (TCM) en iyi uygulama modunu optimize etmek için bir referans sağlar.
Abstract
Serebral iskemi tedavisinde geleneksel Çin tıbbı (TCM) kombinasyonunun avantajları göz önüne alındığında, yaralı PC12 hücrelerini tedavi etmek için iki bitki kombinasyonu stratejisini araştırmak için preparat kombinasyonu ve bileşen kombinasyonu arasındaki etkinlik ve mekanizmadaki farklılıkları inceledik. PC12 hücrelerinin oksidatif hasarını indüklemek için glikozsuz bir ortam ile kombine edilmiş kobalt klorür (CoCl 2) kullanılmıştır. Daha sonra, Astragalus mongholicus (Ast) ve Erigeron breviscapus (Eri ) enjeksiyonunun optimal kombinasyonu seçildi ve PC12 hücreleri üzerindeki güvenli ve etkili konsantrasyonları tarandıktan sonra tek tip tasarım yöntemlerini takiben birleştirildi. Ayrıca, taranan bileşen kombinasyonu iki bitkide 10 μM astragaloside A, 40 μM scutellarin ve 75 μM klorojenik asit içerir. Daha sonra, MTT, Annexin V-FITC / PI, immünofloresan ve Western blot analizi, preparat kombinasyonunun ve hasarlı PC12 hücreleri üzerindeki bileşen kombinasyonunun etkinliğini ve mekanizmasını değerlendirmek için kullanıldı. Sonuçlar, hücre pro-sağkalımı için en uygun preparat kombinasyonunun Ast enjeksiyonu ve 6: 1.8 (μM) konsantrasyonlu Eri kapsülü olduğunu göstermiştir. Bileşen kombinasyonu (10 μM astragaloside A, 40 μM scutellarin ve 75 μM klorojenik asit) preparat kombinasyonundan daha etkiliydi. Her iki kombinasyon da apoptotik hızı, kaspaz-3’ün floresan yoğunluğunu ve hücre içi reaktif oksijen türleri (ROS) seviyesini önemli ölçüde azalttı; Bu arada, p-Akt / Akt, Bcl-2 / Bax ve Nrf2’nin ifade seviyelerini yükselttiler. Bu etkiler bileşen kombinasyonunda daha belirgindi. Sonuç olarak, her iki kombinasyon da PC12 hücrelerinde glikozsuz bir ortam ile birlikte CoCl2 tarafından indüklenen yaralanmayı inhibe edebilir ve böylece hücre sağkalımını teşvik edebilir. Bununla birlikte, bileşen kombinasyonunun preparat kombinasyonu üzerindeki etkinliği, oksidatif stres ve apoptoz ile ilgili PI3K / Akt / Nrf2 sinyal yolunun daha güçlü düzenlenmesinden kaynaklanıyor olabilir.
Introduction
Serebral hipoperfüzyonun neden olduğu kronik serebral iskemi, orta yaşlı ve yaşlı insanlarda sık görülen bir hastalıktır1. Uzun süreli gizli iskemi hastalığı olarak ilerleyici veya kalıcı nörolojik disfonksiyona yol açabilir. Başlıca patolojik mekanizmalar arasında ilerleyici veya kalıcı nörolojik disfonksiyona yol açan hücre apoptozu ve oksidatif hasar; Alzheimer hastalığının, vasküler demansın ve diğer hastalıkların patolojik temelidir ve hastaların yaşam kalitesini ciddi şekilde etkiler. Bununla birlikte, modern tıpta kronik serebral iskemiyi tedavi etmek için hala ideal ilaçların eksikliği vardır2. Aynı zamanda, Astragalus mongholicus (Ast) ve Erigeron breviscapus (Eri) kombinasyonu, geleneksel Çin tıbbının (TCM) klinik uygulamalarında yaygın olarak kullanılmaktadır4. Kombinasyon stratejisi, tek bir ilaçtan daha iyi olan serebral iskemi sonrası sinir fonksiyonunun iyileşmesini teşvik etmede önemli ölçüde gelişmiştir; Bununla birlikte, iki ilacın kombinasyonundaki dozaj oranında büyük farklılıklar vardır4. Etkili bileşenler ve etki mekanizması iyi tanımlanmamıştır, bu da klinik uygulamasını kısıtlayan temel konudur.
Önceki çalışmalar, sıçanlarda serebral iskeminin tedavisinde Ast enjeksiyonu ve Eri enjeksiyonunun hazırlık kombinasyonunun sinerjik etkisini göstermiştir. P-Akt proteininin ekspresyonunu yukarı düzenleyebilir ve B-lenfoblastoma 2 (Bcl-2) ailesi proteinlerinden biri olan ve apoptozu teşvik etme etkisine sahip olan Bcl-2 ilişkili ölüm promotörü (BAD) proteini 5,6’nın ekspresyonunu aşağı regüle edebilir. Bununla birlikte, sinerjik etkisinin maddi temeli ve mekanizması açık değildir. Ayrıca, PC12 hücrelerinin yaralanma modeli CoCl2 kombine glukozsuz ortam ile oluşturulmuş ve Ast ve Eri’deki optimal bileşen kombinasyonu taranmış ve tanımlanmıştır7.
Bu çalışmada, Ast ve Eri’nin etkili dozları, yaralı PC12 hücre modeli kullanılarak taranmıştır. İki ilacın optimal kombinasyonu, homojen tasarım yöntemi ile birlikte bu model kullanılarak taranır. Hücre modeli, yaralı PC12 hücrelerinde preparat kombinasyonunun ve bileşen kombinasyonunun etkileri ve mekanizmalarındaki farkı daha fazla değerlendirmek için kullanılır. Bu strateji, en iyi kombinasyon modunu belirlemek için PI3K / Akt / Nrf2 sinyal yolu aracılığıyla yaralı PC12 hücreleri üzerindeki iki tip kombinasyonun koruyucu etkisini ve düzenleyici mekanizmasını araştırmayı amaçlamaktadır. Bu çalışma, TCM’nin en iyi uygulama modunu optimize etmek için bir referans sunmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modern klinik pratikte serebral iskemi tedavisi için hala ideal ilaç eksikliği vardır2. Qi’nin takviyesi ve kan dolaşımı yönteminin aktive edilmesi rehberliğinde, Ast, Eri ve diğer preparatlar TCM’nin klinik uygulamasında kombinasyon halinde kullanılmış ve iyi kapsamlı avantajlar elde etmişlerdir13,14,15. Çok sayıda çalışma, Ast’ın kan-beyin bariyerinin geçirgenliğini artırabilece…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Sichuan İl Bilim ve Teknoloji Departmanı’nın (2020YFS0325) kilit Ar-Ge projeleri tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 1300 series class II biosafety cabinet | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 1374 | |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
| ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, Inc | – | |
| Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | |
| Analytical flow cytometry | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Annexin V-FITC apoptosis detection kit | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
| Astragalus injection | Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company | A03190612144 | Ast injection |
| Astragaloside A | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 84687-43-4 | |
| Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 60267-1-Ig | |
| BCA protein quantification kit | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
| Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 26593-1-AP | |
| Carbon dioxide incubators | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 0816-2014 | |
| Caspase-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 19677-1-AP | |
| Chlorogenic acid | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 327-97-9 | |
| Cobalt chloride hexahydrate | Merck Biotechnology, Inc. | 7791-13-1 | CoCl2 |
| Dimethyl sulfoxide | Guangzhou saiguo biotech Company | 2020112701 | DMSO |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2020090101 | |
| DMEM high sugar medium | Thermo scientific Hyclone | 2110050 | |
| DMEM sugar free medium | Beijing Solarbio life sciences Company | 2029548 | |
| ECL luminous fluid | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Electrophoresis instrument | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
| Erigeron breviscapus capsule | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | Eri capsule |
| Fetal bovine serum | Four Seasons Institute of Biological Engineering | 20210402 | FBS |
| Fluorescent microscope | Olympms Corporation | IX71-F32PH | |
| Gel imager | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| Goat anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | – | |
| ImageJ 1.8.0 | National Institutes of Health, USA | – | imaging software |
| Immunol fluorescence staining kit | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
| KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
| Marker | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | |
| Microplate reader | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | HH35L2018296 | |
| Motic Inverted microscope | Nanda Scientific Instruments Co. | AE2000LED | |
| NaCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2014081301 | |
| Nonfat milk | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
| Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 16396-1-AP | |
| P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| PC12 cells | Chinese Academy of Sciences | CBP60430 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Thermo scientific Hyclone | SV30010 | |
| Phosphatase protease inhibitor mixture | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
| RI-PA lysis solution | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| SDS-PAGE sample loading buffer, 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| Sterile filter tips (0.22 µm) | Merck Biotechnology, Inc. | SLGP033RB | |
| Tris-base | Guangzhou saiguo biotech Company | 1115GR500 | TBS |
| Trypsin | Thermo scientific Hyclone | J190013 | |
| Tween-20 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021051301 | |
| Vortex oscillator | OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China | VXMNAL | |
| β-actin | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66009-1-Ig |
References
- Mendelevich, E. G. Chronic cerebral ischemia, and dizziness. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).
- Gao, L. Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).
- Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection. Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).
- Bei, N., et al. Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke. Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).
- Tian, F., et al. Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method. China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).
- Li, J., et al. Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).
- Yan, Y., et al. Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).
- . Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69 (2020)
- . Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8 (2020)
- Liu, X., et al. N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation. International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).
- Fan, Y., et al. Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma. Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).
- Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. β-Asarone ameliorates β-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway. Frontiers in Pharmacology. 12, 659955 (2021).
- Li, J., Chen, H. Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine. Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).
- Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia. Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).
- Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).
- Wang, N., Sun, H., Ma, X. Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients. Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).
- Sun, Y. Q. Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats. Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).
- Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
- Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack. Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).
- Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice. Scientific Reports. 10 (1), 6164 (2020).
- El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis. Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619 (2019).
- Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury. Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).
- Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats). Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).
- Luca, M., Luca, A., Calandra, C. The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer’s disease and vascular dementia. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678 (2015).
- Wang, Z., et al. Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).
- Li, H., et al. Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways. Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).
- Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).
- Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617 (2021).
- Yin, L., et al. Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells. Molecules. 26 (10), 2983 (2021).
