Det presenterade protokollet beskriver ett enkelt tillvägagångssätt för screening av proteinkristallisationsförhållanden och kristalltillväxt med hjälp av en dialysplatta med 96 brunnar med hög genomströmning. Användningen av dialysatorrör för storskalig tillväxt av mikrokristaller demonstreras också för seriell kristallografi och MicroED-applikationer.
Att förstå struktur-funktionsförhållandena hos makromolekyler, såsom proteiner, på molekylär nivå är avgörande för biomedicin och modern läkemedelsupptäckt. Hittills är röntgenkristallografi fortfarande den mest framgångsrika metoden för att lösa tredimensionella proteinstrukturer vid atomupplösning. Med de senaste framstegen inom seriell kristallografi, antingen med hjälp av röntgenfrielektronlasrar (XFEL) eller synkrotronljuskällor, har proteinkristallografi utvecklats till nästa gräns, där förmågan att förvärva tidsupplösta data ger viktiga mekanistiska insikter i beteendet hos biologiska molekyler vid rumstemperatur. Detta protokoll beskriver ett enkelt arbetsflöde med hög genomströmning (HTP) för screeningkristallisationsförhållanden genom användning av en dialysplatta med 96 brunnar. Dessa plattor följer Society for Biomolecular Screening (SBS) standard och kan enkelt ställas in med hjälp av något standardkristallisationslaboratorium. När optimala förhållanden har identifierats kan stora mängder kristaller (hundratals mikrokristaller) produceras med hjälp av dialysatorn. För att validera robustheten och mångsidigheten hos detta tillvägagångssätt kristalliserades fyra olika proteiner, inklusive två membranproteiner.
Under det senaste århundradet har röntgenkristallografi varit avgörande för att belysa och förstå struktur-funktionsparadigmet för biologiska makromolekyler. Hittills fortsätter det att vara en av de mest framgångsrika metoderna för att belysa atomupplösningsstrukturer för många unikt olika proteiner som är avgörande för den grundläggande förståelsen av cellbiokemi, medicin och tidig läkemedelsupptäckt 1,2. Proteinkristallisation är dock fortfarande en flaskhals när man studerar många proteinmål, särskilt membranproteiner och stora proteinkomplex3. Följaktligen anses proteinkristallisation nästan alltid vara en konst på grund av de arbetsintensiva trial-and-error-metoderna som används 4,5,6.
Ett utfällningsmedel tillsätts vanligtvis till en proteinlösning vid hög koncentration för att bilda ett välordnat, regelbundet och upprepande gitterarrangemang av proteinmolekyler, kända som kristaller. Under gynnsamma förhållanden, såsom temperatur, pH, koncentration och fällningsmedel, bildas så småningom en övermättad lösning, följt av kristallkärnbildning och tillväxt 7,8. Även om det har skett många framsteg inom kristallisationsförsök, främst med utvecklingen av robotsystem med hög genomströmning och tillgången till färdiga “glesa matris” -skärmar, har de allmänna metoderna för proteinkristallisering i stort sett varit oförändrade genom åren. Vanliga experimentella proteinkristallisationstekniker inkluderar ångdiffusion (hängande droppe och sittande droppe)9, mikrobatch (under olja)10,11, fritt gränssnittsdiffusion (mikrofluidiska enheter)12 och dialys (med knappar och andra tekniker)13,14,15. Men andra mer specialiserade inställningar finns också, såsom mesofasmetoder för kristallisering av membranproteiner16,17. Medan majoriteten av röntgenproteinstrukturer som deponerats i proteindatabanken hittills har lösts genom kristallisation med ångdiffusionsmetoder 6,18, verkar andra metoder, såsom kristallisation genom dialys, vara underutnyttjade, troligen på grund av de praktiska aspekterna relaterade till deras experimentella uppställning.
Kristallisation genom dialys bygger helt enkelt på långsam diffusion av lösta ämnen (fällningsmedel, joner, tillsatser och buffertar) genom ett halvpermeabelt membran som samtidigt förhindrar proteinmolekyler från att cirkulera. På detta sätt bringas proteinlösningen långsamt i jämvikt, med fällningen som når den nödvändiga koncentrationen för att kristallisera. Systemets kinetik beror på temperatur, utfällningskoncentration och cellulosamembranets molekylviktsgräns (MWCO)19. Hittills har den mest populära kristallisationsinställningen genom dialys använt mikrodialysknappar gjorda av transparenta akrylark. Dessa är vanligtvis nedsänkta i reservoarer (mestadels med hjälp av ångdiffusionshängande droppplattor) innehållande kristallisationsutfällningslösningarna. Denna metod med lägre genomströmning kräver emellertid också specifik montering för att täta proteinlösningen i dialysmembranet placerat över knappkammaren, vilket illustreras i figur 1. Dessutom är luftbubblor som fångas mellan dialysmembranet och proteinlösningen ett vanligt problem som försämrar kristalltillväxten. En annan begränsning med metoden är provkraven, där mycket högre koncentrationer och volymer är nödvändiga jämfört med ångdiffusionsmetoder, för att rymma dialysknapparna. Därför har kristallisering med mikrodialysknappar uppfattats som en oattraktiv metod, särskilt för svåra mål som membranproteiner, vars reningsutbyte är frustrerande lågt. Nyligen har mikrofluidiska enheter utvecklats för att underlätta proteinkristallisation genom dialys15. Dessa chips har också utformats för att ha hög röntgentransparens med låg bakgrund, vilket gör att chipsen kan användas för datainsamling in situ vid rumstemperatur, vilket eliminerar besväret med skörd och kryokylning av kristaller. Trots dessa framsteg är tillvägagångssättet fortfarande mycket lågt genomströmning och dyrt.
Figur 1: Schematisk representation av kristallisation genom dialys med dialysknappar. (A) Schematisk representation av en kristallisationsdialysknapp. (B) Proteinlösningen tillsätts till mikrodialysknappkammaren. (C) Dialysmembranet hålls fast vid mikrodialysknappen med hjälp av en gummiring (O-ring) som appliceras via en applikator. (D) Dialysknappen är klar att sänkas ned i behållaren som innehåller kristallisationslösningen (dialyslösningen), såsom visas i (E). Injektionsflaskan med den nedsänkta dialysknappen måste förseglas för att undvika avdunstning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Här presenteras ett enkelt protokoll för screening av proteinkristallisationsförhållanden och kristalltillväxt med hjälp av dialysplattan med 96 brunnar med hög genomströmning. Dessa engångsplattor är utformade för att användas på samma sätt som ångdiffusionskristallisationsplattorna (pipett sedan tätning), som visas i figur 2. Plattorna rymmer upp till 3,2 μL protein och 350 μL dialyslösning. Varje brunn har ett separat regenererat cellulosamembran för att förhindra korskontaminering mellan brunnarna. Installationen tar cirka 10 minuter att slutföra och kräver ingen specialutrustning förutom vad som finns i alla standardkristallisationslaboratorier. Fyra olika proteiner, inklusive två membranproteiner, används för att demonstrera och validera detta tillvägagångssätt som en effektiv metod för proteinkristallografi med hög genomströmning (HTP).
Figur 2: Arbetsflöde för kristallisation med mikrodialysplattan. (A) Avlägsnande av den röda självhäftande “täckfilmen”. (B) Dispensering av proteindropparna i var och en av droppbrunnarna. (C) Brunnarna är täckta med UV-“täckfilmen”. (D) Plattan är inverterad för att tillsätta dialyslösningarna (eller kristallisationsskärmen). E) Plattan förseglas och inkuberas. (F,G) Mikroskopinspektion av dropparna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Användningen av denna kristallisation genom dialysprotokoll demonstrerades med hjälp av dialysatorröret på 0,5 ml (figur 3) för storskalig (hundratals till tusentals) produktion av mikrokristaller, lämplig för toppmoderna datainsamlingsmetoder såsom seriell kristallografi vid båda XFEL-anläggningarna 20,21,22,23,24 och synkrotroner25,26,27 , liksom för MicroED28,29,30-metoder.
Figur 3: Storskalig mikrodialyskristallisation med dialysatorröret . (A) Schematisk representation av dialysatorröret på 0,5 ml. b) Sidovy av en bägare som innehåller kristallisationslösningen och det flytande rörstället som håller ett dialysatorrör. Klicka här för att se en större version av denna figur.
För närvarande är kristallisation genom dialys den mest underutnyttjade kristallisationsmetoden, nämligen på grund av den låga genomströmningen och tråkiga karaktären hos de befintliga metoderna, såsom mikrodialys med knappar. Här följer ett enkelt men robust protokoll ett HTP-arbetsflöde för proteinkristalltillväxt genom dialys genom en kommersiellt tillgänglig mikrodialysplatta och dialysatorrör. Beroende på målproteinet kommer mikrodialysplattan och dialysatorröret som används i proceduren med ett val av ett dialysmembran med en 3, 5, 10 eller 30 kDa MWCO. Protokollet kan enkelt ställas in i vilken standardkristallisationsanläggning som helst och har den stora fördelen att det är tillämpligt på både lösliga proteiner och membranproteiner. Protein-protein och protein-nukleinsyrakomplex testades emellertid inte under detta protokoll.
Som i alla kristallisationsmetoder med dialys är volymförhållandet mellan proteinprovet och dialyslösningen kritiskt. I detta protokoll rekommenderas ett förhållande på 1:100 mellan provet och dialyslösningen, men eftersom mikrodialysplattan tillåter en maximal kapacitet på 350 μL dialyslösning kan dessa förhållanden undersökas för att erhålla kristallträffar. En volym av 1-2 μL protein används i det presenterade protokollet vid inställning av kristallisationsplattor. Detta för att säkerställa att dropparna ställs in exakt med en manuell flerkanalig pipett. Genom att använda elektroniska pipetter (flerkanaliga eller upprepade doseringspipetter) eller HTP-vätskedispenseringsrobotar kan droppar med lägre volymer uppnås exakt, vilket minskar mängden protein som krävs. På grund av de relativt låga volymer dialysbuffert som krävs av mikrodialysplattan (i motsats till andra konventionella dialysmetoder) är det dessutom möjligt (utan omfattande resursanvändning) att utforska stora kemiska utrymmen, inte bara med kommersiellt tillgängliga kristallisationsskärmar utan också med optimeringsskärmar (utformade kring det initiala kristallisationsträfftillståndet).
Ett kritiskt steg i det presenterade HTP-förfarandet är snabb applicering av små proteinvolymer (0,50-3,2 μL per tillstånd) till dialysplattan för att begränsa uttorkning och provförlust. Detta kan enkelt mildras genom att använda en flerkanalig pipett, en upprepad dispenseringspipett eller ett robotkristallisationssystem. Den långa inkubationstiden, till exempel mer än 2 veckor, av plattorna vid 20 °C kan leda till uttorkning av proteindropparna eller skador på de nyligen bildade kristallerna. Att hålla dialysplattorna inuti en befuktningskammare eller en förslutningsbar påse kan lindra denna effekt. Dessutom rekommenderas användning av sterila material och tekniker för att undvika bakterietillväxt.
Som nämnts i inledningen, nyligen, med det ökade behovet av att förstå proteinstrukturdynamik för sjukdomsmekanismer, protein-ligandbindningsinteraktioner och protein-proteininteraktioner, har området proteinröntgenkristallografi revolutionerats genom utveckling av nya och befintliga kristallisationstekniker, moderna metoder för kristallprovleverans, nya generationer av röntgenkällor och nya sofistikerade metoder för datainsamling och bearbetning36 ,37,38. Därför har tillkomsten av seriell mikrokristallografi vid rumstemperatur, antingen utförd med XFEL eller synkrotronljuskällor, framstått som ett anmärkningsvärt verktyg inom strukturbiologi, särskilt inom membranproteiner39. Tusentals mikrokristaller krävs dock för att generera tillräckligt med data för en robust strukturlösning, vilket inte är en lätt uppgift (åtminstone med konventionella kristallisationsmetoder). Dialyskristallisationsmetoden som beskrivs här möjliggör produktion av ett stort antal mikrokristaller. När kristallisationstillståndet för produktion av mikrokristaller (1-10 μm) har bestämts genom användning av en mikrodialysplatta kan stora mängder mikrokristaller med hög densitet produceras med användning av dialysatoranordningen på 0,5 ml (figur 5). Dessa kristaller är idealiska för datainsamling med fasta mål eller leveranssystem för vätskestrålprov27,40. Kristaller erhållna genom denna metod kan också vara lämpliga för MicroED-applikationer. Dessa kan dock behöva fräsas ner till en lämplig storlek och tjocklek för denna specifika applikation, eftersom elektroner interagerar mycket starkare med kristaller än röntgenfotoner41.
Sammanfattningsvis bidrar kristallisationen genom dialysmetoden som beskrivs här till de utvecklande strategierna inom proteinkristallisation för strukturbestämning och utökar utbudet av ansträngningar än vad som kan användas för att bestämma nya proteinmål som tidigare har misslyckats med andra konventionella metoder.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner finansiering från Storbritanniens Department of Business, Energy and Industrial Strategy (BEIS). Vi tackar Alex R. Jones och Mike Shaw från National Physical Laboratory för deras feedback på manuskriptet.
0.2 mL tubes | Thermo Scientific | AB0620 | For aliquoting protein solutions. |
0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17823———-K | Surfactant-free cellulose acetate filters. For filtering dialysis solutions. |
0.22 µm membrane filters | Millipore | GSTF04700 | Membrane filters for filtering large volumes of buffers |
12-channel, variable 0.5 – 10 µL Research plus pipette | Eppendorf | 3125000028 | For dispensing protein drops onto the Diaplate. |
12-channel, variable 30 – 300 µL Eppendorf Research plus pipette | Eppendorf | 3125000060 | For dispensing dialysis solutions on the Diaplate reservoirs. |
20 mL syringe | Fisherbrand | 15889152 | For use with syringe filters. |
96 well 2.2 mL deep-well plates | Thermo Scientific | AB0788 | Polypropylene deep-well storage plates; for preparing screens using the Hamilton Microlab STARlet. |
Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000565 | With rotor FA-24×2 with a maximum g-force of 21,300 x g. |
Diacon dialyser | SWISSCI | W72010 | Dialyzer tubes with a regenerated cellulose membrane with a molecular weight cut-off of 10 kDa. Ideal for protein solutions of up to 0.5 mL. |
Diaplate 96-well plate | SWISSCI | W82010 | Microdialysis plate. The Diaplate consists of two sides with a regenerated cellulose membrane in-between with a molecular weight cut-off of 10 kDa. |
Falcon 50 mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning | 352070 | For holding dialysis solutions. |
Floating rack | SWISSCI | n/a | Included in the Diacon kit |
Floor-standing vibration-free incubator | Molecular Dimensions | MD5-01 | 400 L temperature-controlled incubator set to 20 °C. |
Leica M205 C stereo microscope | Leica | Planapo 1.0x objective, 7.8x – 160x zoom range with DMC 4500 camera | |
Lysozyme from chicken egg white | Sigma Aldrich | 62971 | Lyophilized protein |
Memgold2 | Molecular Dimensions | MD1-64 | Sparse-matrix screen |
Microlab STARlet | Hamilton | n/a | Liquid handler system. |
Reservoir cover film | SWISSCI | n/a | Included in the Diaplate kit |
Reusable bottle top filter | Thermo Scientific | DS0320-5045 | For fitering large volumes of buffers, for use with 0.22 µm membrane filters |
Sealing paddle | SWISSCI | n/a | Included in the Diaplate kit |
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma Aldrich | T7638 | Lyophilized protein |
UV cover film | SWISSCI | n/a | Included in the Diaplate kit |