يحدد هذا البروتوكول تجربة الهجرة في المختبر المناسبة للتحليل الوظيفي للجزيئات المشاركة في الهجرة في الجسم الحي لخلايا القمة العصبية إلى المصفوفة خارج الخلية الغنية بالهيالورونان.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في المختبر التحقيق في آثار المصفوفة خارج الخلية الغنية بالهيالورونان على هجرة خلايا القمة العصبية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
خلايا القمة العصبية (NCCs) هي خلايا شديدة الارتحال تنشأ من المنطقة الظهرية للأنبوب العصبي. تعد هجرة الخلايا الخيطية من الأنبوب العصبي عملية أساسية لإنتاج NCC وهجرتها اللاحقة نحو المواقع المستهدفة. يتضمن مسار هجرة NCCs ، بما في ذلك أنسجة الأنبوب العصبي المحيطة ، مصفوفة خارج الخلية غنية بالهيالورونان (HA). لنمذجة هجرة NCC إلى هذه الأنسجة المحيطة الغنية ب HA من الأنبوب العصبي ، تم إنشاء اختبار هجرة الركيزة المختلطة الذي يتكون من HA (متوسط الوزن الجزيئي: 1,200-1,400 kDa) والكولاجين من النوع الأول (Col1) في هذه الدراسة. يوضح اختبار الهجرة هذا أن خلايا خط خلايا NCC ، O9-1 ، مهاجرة للغاية على الركيزة المختلطة وأن طلاء HA يتحلل في موقع الالتصاقات البؤرية أثناء الهجرة. يمكن أن يكون هذا النموذج في المختبر مفيدا لمزيد من الاستكشاف للأساس الميكانيكي الذي ينطوي عليه هجرة NCC. ينطبق هذا البروتوكول أيضا على تقييم ركائز مختلفة كسقالات لدراسة هجرة NCC.
المقدمة
خلايا القمة العصبية (NCCs) هي مجموعة خلايا متعددة القدرات موجودة في الأجنة النامية ، وتنشأ من حدود الصفيحة العصبية أثناء العصبية. أنها تسهم في تشكيل مجموعة متنوعة من الأنسجة ، بما في ذلك الجهاز العصبي المحيطي ، ونظام القلب والأوعية الدموية ، والأنسجة القحفية الوجهية ، والهيكل العظمي1. بعد الحث ومواصفات NCC على حدود الصفيحة العصبية ، تهاجر NCCs من الظهارة العصبية وتهاجر نحو مواقع الأنسجة المشتقة من NCC1.
الهيالورونان (HA) هو جليكوزامينوجليكان غير كبريتي يتم توزيعه في مجموعة متنوعة من الأنسجة كمكون للمصفوفة خارج الخلية (ECM). تم إثبات أهمية HA في تطور الجنين في الأنظمة النموذجية من خلال استئصال ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في كلية الدراسات العليا لطب الأسنان بجامعة أوساكا.
1. ثقافة خلايا قمة الجمجمة العصبية الفأر
ملاحظة: يتكون خط خلايا القمة العصبية المستخدم في هذه الدراسة من خلايا O9-1 ، المشتقة أصلا من Wnt1-Cre. الخلايا المعبرة عن R26R-GFP المعزولة من أجنة الفئران E8.512 (انظر المناقشة). تتبع الطريقة الموضحة هنا لزراعة خلايا O9-1 البروتوكول13 الذي تم إنشاؤه مسبقا.
- تحضير لوحة مصفوفة الغشاء القاعدي.
- قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي (انظر جدول المواد) على الج....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم إجراء اختبار الهجرة على ركائز مختلطة تتكون من Col1 والوزن الجزيئي العالي HA (متوسط الوزن الجزيئي: 1,200-1,400 كيلو دالتون) باستخدام البروتوكول الموضح هنا. تم العثور على خلايا O9-1 عند حدود الفجوة تهاجر بسهولة إلى الفجوة الغنية ب HA (الشكل 4). أكد التلوين المناعي لعلامة FA ، vinculin14 ، أن خلايا O9-1 شكلت التصاقات بؤرية (FAs) في مواقع تدهور HA (الشكل 5).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تنظم مكونات ECM المختلفة الهجرة / الهجرة NCC. على سبيل المثال ، ينظم HA بشكل إيجابي ترحيل NCC 2,15. ومن المثير للاهتمام ، أن دراسة تستند إلى نماذج الفئران الجينية ل Tmem2 ، وهو هيالورونيداز سطح الخلية ، أوضحت متطلبات تدهور HA في هجرة NCC9. الكولاجين وفير أيضا في ECM المحيط بالأنبوب العصبي16. ثبت أن Decorin ، وهو بروتيوغليكان صغير غني بالليوسين ، ينظم هجرة NCC أثناء التطور العصبي17. تؤثر مكونا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن صاحب البلاغ أنه لا توجد مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
أعرب عن تقديري الكبير لفوميتوشي إيري ويو ياماغوتشي لتشجيعهما واقتراحاتهما الطيبة في إنشاء هذه الطريقة. تم دعم هذا العمل من خلال المنح المساعدة لبرامج البحث العلمي من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (#19KK0232 إلى TI ، #20H03896 إلى T.I.). تم وصف الطريقة الأصلية لطلاء HA على ركائز زجاجية ومقايسات تحلل HA في الموقع على الركائز في Yamamoto et al. (2017) 8 ، بينما تم وصف طريقة تحضير ركائز HA / Col1 المختلطة في Irie et al. (2021) 7.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| طبق ثقافة الخلايا 10 سم | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. لا. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. رقم 80209 | |
| Alexa 555 علامة الماعز المضادة للفأر IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | الماعز مشتق من الأجسام المضادة الثانوية المضادة للفأر |
| عداد الخلايا الآلي | Bio-Rad | Cat. لا. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | CAT. 11910 | خلية تجميد |
| متوسط الكولاجين من النوع الأول | سيجما | كات. رقم 08-115 | |
| خلية ES كاملة متوسطة | Millipore | Cat. لا. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco ' s معدل النسر المتوسط | Gibco | Cat. 11971025 | |
| مصل الأبقار الجنين | Gibco | Cat. 10270106 | |
| المجهر الفلوري | Keyence | Cat. لا. BZ-X700 | |
| Fluoresent المسمى HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas الطبق السفلي | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| الجلوتالديهايد | سيجما | كات. رقم G5882 | |
| ماتريجل | فيشر | كات. لا. CB-40234 | مصفوفة الغشاء القاعدي |
| أحادية النسيلة المضادة للفينكولين الأجسام المضادة | Sigma | Cat. لا. V9264 | |
| تصاعد وسائل الإعلام | داكو | S3023 | |
| مصل الماعز العادي | فيشر | كات. 50062Z | |
| O9-1 خلايا | ميليبور | القط. لا. SCC049 | |
| بارافورمالدهايد | سيجما | القط 158127 | |
| ثلاثي إيثوكسيسيلان | سيجما | كات. رقم 390143 | |
| التربسين EDTA | ميليبور | كات. لا. SM-2003-C |
المراجع
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326(2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is req....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
