Multiplekset strekkodingsbildeanalyse har nylig forbedret karakteriseringen av tumormikromiljøet, noe som tillater omfattende studier av cellesammensetning, funksjonell tilstand og celle-celle-interaksjoner. Her beskriver vi en farge- og avbildningsprotokoll ved hjelp av strekkoding av oligonukleotid-konjugerte antistoffer og syklusavbildning, som muliggjør bruk av en høydimensjonal bildeanalyseteknikk.
Multiplexed imaging teknologi ved hjelp av antistoffstrekkoding med oligonukleotider, som sekvensielt oppdager flere epitoper i samme vevsseksjon, er en effektiv metodikk for tumorevaluering som forbedrer forståelsen av tumormikromiljøet. Visualiseringen av proteinuttrykk i formalinfiksert, parafininnebygd vev oppnås når en spesifikk fluorofor er glødet til en antistoffbundet strekkode via komplementære oligonukleotider og deretter prøveavbildning utføres; Faktisk tillater denne metoden bruk av tilpassbare paneler med mer enn 40 antistoffer i en enkelt vevfargingsreaksjon. Denne metoden er kompatibel med ferskt frosset vev, formalinfiksert, parafininnebygd vev, dyrkede celler og mononukleære celler i perifert blod, noe som betyr at forskere kan bruke denne teknologien til å se en rekke prøvetyper ved enkeltcelleoppløsning. Denne metoden starter med en manuell farge- og festeprotokoll, og alle antistoffstrekkodene påføres ved hjelp av en antistoffcocktail. Instrumentet for fargefluidikk er helautomatisert og utfører iterative sykluser med merking, avbildning og fjerning av spektralt distinkte fluoroforer til alle biomarkørene er avbildet ved hjelp av et standard fluorescensmikroskop. Bildene blir deretter samlet og kompilert på tvers av alle bildebehandlingssyklusene for å oppnå enkeltcelleoppløsning for alle markørene. Enkelttrinnsfarging og skånsom fluoroforfjerning tillater ikke bare svært multiplekset biomarkøranalyse, men bevarer også prøven for ytterligere nedstrømsanalyse om ønskelig (f.eks. Hematoksylin- og eosinfarging). Videre muliggjør bildeanalyseprogramvaren bildebehandling-driftkompensasjon, bakgrunnssubtraksjon, cellesegmentering og klynger – samt visualisering og analyse av bildene og cellefenotypene for generering av romlige nettverkskart. Oppsummert benytter denne teknologien et datastyrt mikrofluidikksystem og fluorescensmikroskop for iterativt å hybridisere, avbilde og stripe fluorescerende merkede DNA-prober som er komplementære til vevbundne, oligonukleotid-konjugerte antistoffer.
Tumormikromiljøet (TME) er ekstremt heterogent, bestående av tumorceller, tumorstromale celler, immunceller, ikke-cellulære komponenter i den ekstracellulære matrisen og mange rikelig molekyler produsert og frigjort av tumor-, stromal- og immunceller 1,2. Akkumulerende bevis viser at TME har en sentral rolle i omprogrammering av tumordifferensiering, vekst, invasjon, metastase og respons på terapier3.
Å forstå hvordan ulike celletyper i TME samhandler og kommuniserer med hverandre gjennom signalnettverk er avgjørende for å forbedre kreftdiagnosen, optimalisere immunterapi og utvikle nye behandlinger4. Tradisjonelle vevsmikroskopiteknikker, inkludert immunhistokjemi (IHC) og immunfluorescens (IF), har blitt brukt i flere tiår for å studere celletyper, overflod og kommunikasjon i tumorprøver. Dessverre kan disse teknikkene vanligvis bare evaluere en eller to proteinmarkører i en vevsseksjon og kan ikke avsløre de komplekse romlige og strukturelle forholdene mellom disse cellene 5,8,7.
I løpet av de siste to tiårene har flere multipleksede bildeteknologier blitt etablert8. Disse teknologiene gir mye bedre oversikt over sammensetningen, funksjonen og plasseringen av immunceller i TME, noe som fører til raske fremskritt i evnen til å identifisere og romlig profilere komplekse TMEer på enkeltcellenivå 9,10. De romlige og strukturelle forholdene mellom ulike tumor- og immunceller i TME er nå i forkant av biologiske og kliniske studier ved bruk av disse multipleksede bildeteknologiene11,12.
Den nylig utviklede multipleksede bildebehandlingsteknologien ved bruk av oligonukleotidkonjugert antistoffstrekkoding er en innflytelsesrik enkeltcellebiologisk forskningsplattform basert på påvisning av oligonukleotidkonjugerte antistoffer i formalinfikserte, parafininnebygde (FFPE) prøver13,14. For tiden tillater denne multipleksede bildeteknologien samtidig avbildning av mer enn 100 markører i en enkelt vevsseksjon15, noe som har økt antall celletyper som kan skilles in situ. Dette muliggjør et nivå av romlig analyse av tumor- og immunceller som ikke er mulig ved bruk av tradisjonelle immunfenotypingstilnærminger16.
Her beskriver vi en optimalisert protokoll for konjugering av rensede antistoffer mot oligonukleotider og validering av denne konjugeringen ved hjelp av multiplekset bildebehandlingsplattform og en multisyklusavbildningsprosedyre med FFPE-vev. I tillegg beskriver vi de grunnleggende prosedyrene for bildebehandling og dataanalyse som brukes med denne teknologien.
TME spiller en viktig rolle i kreftutvikling, progresjon og behandlingsrespons. I tillegg kan tettheten av spesifikke tumorinfiltrerende lymfocyttundergrupper i TME tjene som en prognostisk biomarkør for visse typer kreft. Bemerkelsesverdig, i tillegg til TMEs cellulære sammensetning, kan de romlige egenskapene til en svulst gi en oversikt for å forstå svulstens biologi og identifisere potensielle prognostiske biomarkører12,17.
Siden mange immuncellepopulasjoner er involvert i procancer- eller kreftrespons, vil en bedre forståelse av disse cellene og deres romlige forhold til hverandre og med kreftceller bidra til å identifisere nye immunterapeutiske strategier. Tidligere studier har stratifisert plasseringen og romlig fordeling av TME-celler basert på vevstrukturen i de intratumorale og peritumorale områdene og de invasive marginene til tumorcellene18,19. I løpet av de siste 15 årene har teknologiske fremskritt gjort fenotypisk analyse av individuelle celler basert på deres romlige spredning til et nytt, innflytelsesrikt verktøy for å studere TME og kategorisere potensielle biomarkører for tumorimmunterapi. Multiplex IF histokjemi kan samtidig estimere flere biologiske markører20.
I likhet med oligonukleotid-konjugert antistoffstrategi, brukes fire typer proteinbaserte multiplexplattformer for å studere TME: kromogen-, fluorescens-, DNA-strekkode- og metallisotopmerkede antistoffdeteksjonssystemer. De kostnadseffektive kromogene IHC-plattformene muliggjør visualisering av hele lysbildet og patologisk vurdering ved bruk av konvensjonell lysfeltmikroskopi. I multiplekset IF og IHC brukes antistoffer konjugert med fluoroforer. Multiplex IF/IHC-plattformen oppdager antistoffer med høy spesifisitet og kan kvantifisere målrettede antistoffer selv på subcellulært nivå 6,21. I tillegg, på grunn av naturen til kromogener og fluoroforer, kan bruken av ett antistoffpanel fange uttrykket av opptil 10 biomarkører på et enkelt lysbilde. På metallisotopbaserte plattformer brukes metallmerkede antistoffer til å utføre multiplekset avbildning med encelle- og romlig oppløsning, og høy sensitivitet for individuelle vevssnitt22. Teoretisk sett muliggjør disse metallkonjugerte antistofftilnærmingene samtidig påvisning av mer enn 100 biomarkører på en enkelt vevsseksjon. En utfordring med isotopmerkingsteknikken er isobarisk interferens, som forhindrer at 100% renhet av anrikning nås23. Videre øker interferensen etter hvert som antall markører øker. DNA-konjugerte antistoffdeteksjonsplattformer gjenkjenner antistoffer merket med unike DNA-strekkoder. Mer enn 40 biomarkører kan fanges samtidig med høy spesifisitet på disse plattformene6.
Multiplexed imaging er en kommersielt tilgjengelig DNA-strekkodemerket antistoffdeteksjonsplattform for påføring av DNA-konjugerte antistoffer til et enkelt vevslysbilde i ett trinn (figur 8). For vevpreparasjonstrinnet, i motsetning til den multipleksede ionstråleavbildningsplattformen, som krever bruk av gullbelagte lysbilder oppnådd fra produsenter, krever den multipleksede bildebehandlingsplattformen bare vanlige deksler eller lysbilder belagt med 0,1% poly-L-lysin for å hjelpe vevet til å feste seg til det og holde vevet intakt under farge- og avbildningsprosessen. Bruk av vevssnitt på dekksedler innen 4 uker etter snitting anbefales, da langvarig lagring av ufargede lysbilder resulterer i reduksjon av antigenisitet. En farget dekkprøven kan oppbevares i lagringsbuffer ved 4 °C i opptil 2 uker uten å miste fargesignalet. Det kreves ikke noe spesielt utstyr for oppbevaring av dekkprøvene. Det multipleksede bildebehandlingssystemet har blitt oppgradert til å bruke vanlige lysbilder i stedet for dekkslips, noe som muliggjør farging av større vev og enkel håndtering. Ved bruk av en reduksjonsløsning for antistoffkonjugering (trinn 3.2.3), bør reaksjonen begrenses til ikke mer enn 30 minutter for å forhindre skade på antistoffer. Blokkeringsbufferne i trinn 5.6.6 bør tilberedes på nytt, og blokkeringsbufferne må ikke brukes på nytt.
Sammenlignet med kromogen-, fluorescens- og metallisotopmerkede multipleksantistoffdeteksjonsplattformer, har den multipleksede bildeteknologien visse fordeler. For eksempel er mer enn 60 forhåndsdesignede antistoffpaneler for multiplekset avbildning kommersielt tilgjengelige, noe som bidrar til å spare tid og kostnader ved antistoffkonjugering og validering, og antall forhåndsdesignede antistoffpaneler vokser. Disse antistoffene, som inkluderer karsinommarkøren pan-cytokeratin, melanommarkøren SOX10, vaskulær markør CD31, stromalmarkøren SMA og mange immuncellemarkører, er validert og eksperimentklar. For antistoffer som ikke er forhåndsdesignet, er det kommersielt tilgjengelige konjugasjonssettet designet for bruk med multiplekset avbildning grei og brukervennlig. Kundekonjugerte antistoffer er gode i 1 år når de oppbevares ved 4 °C. I tillegg er maskinoppvarming ikke nødvendig for å ta bildene. I denne multipleksede bildeteknologien resulterer de iterative vaske-, hybridiserings- og strippetrinnene i bildeopptaket sjelden i redusert markørintensitet eller degradert vevsmorfologi 5,24,25. Videre er sammensatte bilder tatt i QPTIFF-format med et enkelt trefarget fluorescensmikroskop og kan lastes opp og analyseres ved hjelp av tredjeparts digital analyseprogramvare. Fargemarkørene kan visualiseres ved encelleoppløsning, og cellefenotyper kan karakteriseres ved samlokalisering av markørene (figur 6 og figur 7). Den omfattende analysen av et multiplekset bilde avslører videre vevsrommene, enkeltcellemarkørkvantifisering og nærmeste nabo- og nærhetsdata (figur 8).
En utfordring i multiplekset bildeanalyse er identifisering av celletype. Vanligvis, når flere enkeltobjektklassifiserere brukes på et bilde, vil mer uvanlige fenotyper bli kommentert. Derfor anbefales det å bruke kjente markører som ikke uttrykkes samtidig i samme klassifikator og bare bruke den fenotyperelaterte klassifikatoren til annotasjonen av enkeltceller. Variasjoner i celletypeannotasjon vil resultere i vesentlig forskjellige romlige resultater, for eksempel forskjeller i celleromlig fordeling og cellulær nabolagsanalyse26,27.
Multiplekset bildeanalyse har vist seg å være vellykket i farging og avbildning av mange prøvetyper, inkludert FFPE-vev, ferskt frosset vev, arkiverte hele lysbilder og vevsmikromatriser. Multipleksede bilder av bryst-, hjerne-, lunge-, milt-, nyre-, lymfeknute- og hudvevsseksjoner kan anskaffes med dype enkeltcellede romlige fenotypingsdata 5,16,25,28.
I fremtiden forventes flere forhåndsdesignede antistoffer for multiplekset avbildning. I tillegg er det stort behov for utvikling av spesifikk programvare for multiplekset bildeanalyse. For tiden finnes det mange kommersielt tilgjengelige og åpen kildekode-programmer for Hi-Plex bildeanalyse29, men forskere trenger fortsatt hjelp til å lage en standard arbeidsflyt for disse analysene30,31. Selv om sammensatte bilder tatt med denne protokollen er kompatible med tredjeparts programvare, kan dette føre til ekstra kostnader for brukeren. En annen ulempe med den multipleksede bildebehandlingsteknologien er signalreduksjonen i nukleær proteindeteksjon etter iterativ vasking, hybridisering og stripping med store paneler av antistoffer. Heldigvis kan dette minimeres ved å hente de strekkodede fluoroforene i tidlige sykluser når du designer reporterplatene. Nylig ble denne plattformen oppgradert med et nytt høyhastighets skanningssystem, noe som dramatisk har redusert tiden for å skaffe komposittbilder32. I tillegg har en ny strategi som bruker tyramidkonjugerte strekkoder blitt rapportert for å forbedre oligonukleotid-konjugert antistoff strekkodingsbasert avbildning. Denne teknologien tar sikte på å forsterke fargesignaler der strekkodekonjugerte antistoffer er vanskelig å oppnå33.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Donald R. Norwood fra Editing Services, Research Medical Library ved MD Anderson for redigering av denne artikkelen og multiplex IF og bildeanalyselaboratorium ved Institutt for translasjonell molekylær patologi ved MD Anderson. Dette prosjektet ble støttet delvis av Translational Molecular Pathology-Immunoprofiling laboratory (TMP-IL) Moonshots Platform ved Institutt for translasjonell molekylær patologi, University of Texas MD Anderson Cancer Center og NCI Cooperative Agreement U24CA224285 (til MD Anderson Cancer Center CIMAC).
10x AR9 Buffer | Akoya Biosciences | AR900250ML | |
10x Buffer | Akoya Biosciences | 7000001 | |
16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28906 | |
1X Antibody Diluent/Block | Akoya Biosciences | ARD1001EA | |
Antibody Conjugation Kit | Akoya Biosciences | 7000009 | Contains Filter Blocking Solution, Antibody Reduction Solution 1, Antibody Reduction Solution 2, Conjugation Solution, Purification Solution, Antibody Storage Solution |
Assay Reagent | Akoya Biosciences | 7000002 | |
Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
Dimethyl sulfoxide | Avantor/VWR | BDH1115-4LP | |
Ethanol, 200 proof | |||
G Blocker V2 | Akoya Biosciences | 240199 | |
Histoclear | Thermo Fisher Scientific | 50-329-50 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
Milli-Q Integral 10 | Millipore | ZRXQ010WW | |
Niknon Fluorescence microscope | Keyence Corp. of America | BZ-X810 | |
Nuclear Stain | Akoya Biosciences | 7000003 | |
Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
NuPAGE | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
PhenoCycler Barcodes/Reporters Combination | Akoya Biosciences | 5450004 (BX025/RX025) | |
5450003 (BX022/RX022) | |||
5450023 (BX002/RX002) | |||
5250002 (BX020/RX020) | |||
2520003 (BX023/RX023) | |||
5250005 (BX029/RX029) | |||
5250007 (BX035/RX035) | |||
5250012 (BX052/RX052) | |||
5550012 (BX030/RX030) | |||
5550015 (BX042/RX042) | |||
5550014 (BX036/RX036) | |||
QuPath | Open-Source | https://qupath.github.io/ | |
SimplyBlue SafeStain | Thermo Fisher Scientific | LC6065 | |
Staining Kit | (Akoya Biosciences | 7000008 | Contains Hydration Buffer, N Blocker, J Blocker, S Blocker, Fixative Reagent, Storage Buffer |