Her præsenterer vi en protokol til isolering af kerner fra flashfrosne, arkiverede levervæv til enkeltkerne RNA-seq, ATAC-seq og fælles multiomics (RNA-seq og ATAC-seq).
Leveren er et komplekst og heterogent væv, der er ansvarlig for at udføre mange kritiske fysiologiske funktioner, såsom vedligeholdelse af energihomeostase og metabolisme af xenobiotika, blandt andre. Disse opgaver udføres gennem tæt koordinering mellem hepatiske parenkymale og ikke-parenkymale celler. Derudover er forskellige metaboliske aktiviteter begrænset til bestemte områder af leverlobule-et fænomen kaldet leverzonation. Nylige fremskridt inden for enkeltcellesekventeringsteknologier har givet forskere mulighed for at undersøge vævs heterogenitet ved en enkeltcelleopløsning. I mange komplekse væv, herunder leveren, kan barske enzymatiske og / eller mekaniske dissociationsprotokoller negativt påvirke levedygtigheden eller kvaliteten af de enkeltcellesuspensioner, der er nødvendige for omfattende karakterisering af dette organ i sundhed og sygdom.
Dette papir beskriver en robust og reproducerbar protokol til isolering af kerner fra frosset, arkiveret levervæv. Denne metode giver kerner af høj kvalitet, der er kompatible med downstream, enkeltcelle omics-tilgange, herunder enkeltkerne RNA-seq, assay for transposase-tilgængelig kromatin med high-throughput sekventering (ATAC-seq) samt multimodal omics (fælles RNA-seq og ATAC-seq). Denne metode er med succes blevet anvendt til isolering af kerner fra sunde og syge humane, mus og ikke-menneskelige primat frosne leverprøver. Denne tilgang tillader upartisk isolering af alle de vigtigste celletyper i leveren og tilbyder derfor en robust metode til at studere leveren ved enkeltcelleopløsningen.
Enkeltcellegenomik er hurtigt ved at blive en vigtig metode til at studere leverfunktion og vurdere virkningen af cellulær heterogenitet i sundheds- og sygdomstilstande1. Den hurtige udvikling af “multiomics” til samtidig måling af forskellige lag af information og den parallelle udvidelse af robuste beregningsrørledninger baner vejen for opdagelsen af tidligere ukendte celletyper og undertyper i den normale og syge lever2.
Muligheden for at udforske biobanker og arkiverede frosne prøver har signifikant øget mulighederne for at revidere og opdage rollen som ikke-parenkymale celler 3,4,5 og undersøge rollen som polyploide hepatocytter under aldring og i kroniske sygdomme 6,7,8,9 . Derfor beskriver dette papir en robust og reproducerbar enkeltkerneisoleringsprotokol for flashfrosne (FF) arkiverede lever, der er kompatible med downstream single-nucleus RNA-sekventering og ATAC-sekventering samt med multimodal omics (fælles RNA-seq og ATAC-seq) (figur 1).
Denne arbejdsgang giver mulighed for undersøgelse af transkriptomet og kromatintilgængeligheden af alle celletyper i leveren, uafhængigt af cellestørrelsen eller skrøbeligheden, i enzymatiske dissociationsprotokoller. Det kan udføres med små vævssektioner (15-30 mg eller 5-10 mm3) fra dyrebare humane prøver eller transgene mus. Bestemmelse af kerneisoleringens høje renhed inkluderer kvantificering og måling af den nukleare størrelse, som kan korrelere med øget cellestørrelse og ældning 10,11, og denne renhed er relevant for analysen af både hepatocytploidi 12 og cellestørrelsesafhængige transkriptionelle mekanismer11,13,14,15 . Derudover bevarer kerner isoleret fra frosne lever værdifuld information om leverbeboelse. Arbejdsgangen og vævsindsamlingen giver mulighed for validering af enkeltcellegenomiske data eller yderligere komplementære analyser, såsom immunohistokemi eller rumlig transkriptomik fra det samme væv og det samme individ. Derfor kan denne tilgang anvendes til flere leversygdomstilstande og modelorganismer systematisk og pålideligt.
Dissekering af leverens cellulære sammensætning af enkeltcelle eller enkeltkerne RNA-seq giver en dybere forståelse af udvikling og progression af leversygdom 3,4,5,24. Enkeltcelleisolering fra lever er tidskrævende og kræver protokoller, der involverer hård mekanisk eller enzymatisk dissociation25,26,27. Det er almindeligt accepteret, at hvert væv kræver en systematisk evaluering for at bestemme den optimale vævsdissociationsprotokol samt en passende opbevaringsmetode til at fange skrøbelige celletyper eller kerner28. Afhængigt af vævets tilgængelighed, sygdom af interesse, udviklingsstadium eller modelorganisme kan fremstilling af en enkeltkernesuspension til downstream-behandling være en mere egnet metode end anvendelse af enkeltcellesuspensioner. Det er vigtigt, at scRNA-seq og snRNA-seq i leveren har vist en høj korrelation mellem nukleart og cytoplasmatisk mRNA, hvilket tyder på, at begge tilgange præsenterer komplementær information 2,3,4,6,29.
Dette papir giver en standardiseret, robust og reproducerbar enkeltkerneisolering fra frosne, arkiverede leverprøver fra mus og andre arter, herunder mennesker og makaker. Denne metode kan bruges til vildtypemus fodret med chow og en fedtfattig diæt (HFD) og til musemodeller af leverfibrose ved hjælp af både godt pladebaserede og dråbebaserede enkeltkernegenomiske tilgange6. Denne metode er afhængig af den protokol, der oprindeligt blev beskrevet for hjernevæv af Krishnaswami et al.30 med yderligere modifikationer skræddersyet til flashfrossen lever. Optimal homogenisering frigør de fleste kerner fra vævet uden at påvirke kernemembranens integritet negativt. Overdouncing kan dog skade de skrøbelige kerner og reducere deres samlede kvalitet. Unge og / eller fedtlever kræver normalt kun 5 slag med pestle A og 10 slagtilfælde med pistil B, mens gamle og / eller fibrotiske lever kan kræve 15 slagtilfælde med pistil B, men ikke mere. Det anbefales derfor ikke at udføre flere slag ud over de tal, der er angivet her. Overdouncing kan påvirke kvaliteten af enkeltkernesuspensionen negativt og øge mængden af omgivende RNA. Efterfølgende kan dette føre til behovet for at udføre yderligere beregningsfiltreringstrin under downstream-dataanalyserne.
Protokollen, der præsenteres her, er alsidig og kan justeres til forskellige leverforhold hos unge (3 måneder) og gamle (24 måneder) mus. Da vi fandt ud af, at en større del af leveren er nødvendig for gamle, HFD og fibrotiske væv, kan størrelsen af det væv, der er tilgængeligt til behandling, udgøre en begrænsning for nogle brugere med mindre mængder biologisk startmateriale. Gradientrensning anbefales dog stærkt til øjeblikkelig prøvebehandling med dråbebaserede genomiske assays. Hvis kernerne skal FACS sorteres i 96-/384-brøndplader til velbaserede assays, kan gradientrensning udelades. Vi opfordrer brugerne til stadig at udføre gradientrensningen, hvis der er nok vævsprøve til at opnå den anbefalede kernekoncentration til FACS-sortering (dvs. ~ 1 × 105 kerner / ml).
Leveren er karakteriseret ved den polyploide karakter af hepatocytter9, men hepatocytploididens rolle i normal fysiologi og sygdom er endnu ikke klar. Der er en voksende mængde beviser, der tyder på, at ploidy giver genomisk variabilitet31, og det er velkendt, at ploidy stiger medalderen 32,33. Berigelsen af mononukleerede tetraploide hepatocytter er imidlertid også klinisk forbundet med dårlig prognose i humant hepatocellulært karcinom (HCC)34. Tilsvarende er ændringer i hepatocyt ploidiniveauer forbundet med aldringsrelaterede kroniske leversygdomme såsom ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD)35,36,37. Ploidy er betingelsen for at besidde mere end to kopier af genomet, som kan udforskes ved at farve genomindholdet med et DNA-farvestof som Hoechst38. Hoechst-farvestof, der tilsættes HB før ekstraktion, mærker alle kernerne under isolationsprotokollen. Dette gør det muligt at skelne mellem diploide og polyploide kerner baseret på deres DNA-indhold, når de ophidses af en UV (350 nm) eller violet (450 nm) laser på et flowcytometriinstrument. Med den fremviste gating-strategi kan 2n, 4n, 8n og højere niveauer af hepatocytploidi undersøges i frosne, arkiverede lever for bedre at forstå rollen som cellulær heterogenitet i vævsfunktion1 (figur 3A). Desuden kan den nukleare morfologi, herunder størrelse og volumen, kvantificeres ved hjælp af billeddannelsesflowcytometri for at korrelere ændringer i kernestørrelsen med ændringer i det samlede antal tællinger eller antal gener afhængigt af ploidiniveauet (figur 3B, C).
Multimodal omics-måling giver mulighed for at undersøge flere lag af genomisk organisation samtidigt. Den fælles RNA + ATAC multiomics-tilgang tillader undersøgelse af opstrømsregulatorer og nedstrøms metaboliske gener, hvilket giver en omfattende tilgang til undersøgelse af transkriptionelle netværk og kromatinarkitekturen forbundet med leverfunktionen ved enkeltcelleopløsningen. Med fremskridtene inden for beregningsmetoder, der kan tage højde for datasparsomhed og reduktionen i sekventeringsomkostninger, er enkeltcelle multiomics banebrydende for vurderingen af flere modaliteter fra den samme celle. Denne enkeltkerneisoleringsprotokol er kompatibel med den individuelle og fælles vurdering af ekspressions- og kromatindatasæt. Vi har brugt standardrørledninger etableret af Stuart et al.23 (Signak-pakke) til at illustrere kvaliteten af dataene, mens flere tilgængelige og alternative beregningsmetoder let kan anvendes til downstream-analyser23,39,40,41.
Samlet set tillader enkeltkernemultiomics undersøgelse af bioarkiveret, FF-mus, humant og ikke-humant primatlevervæv ved hjælp af en meget lille mængde startprøvemateriale ved at implementere kerneekstraktionsprotokollen, der præsenteres her. Dette uvurderlige værktøj vil give leverbiologer mulighed for at forhøre både genekspression og kromatintilgængelighed i forbindelse med forskellige leverpatologier. Derudover kan forskellige niveauer af hepatocytploidi og den resulterende justering af genekspression afhængigt af deres placering i leverlobulen afsløre deres rolle i leverpatologier. Derfor forventer vi, at undersøgelsen af cellulær heterogenitet vil give nye muligheder for udvikling af præcisionsmedicin og målrettede interventioner mod sygdomme som HCC og NAFLD.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af Helmholtz Pioneer Campus (MS, KY, CPM-J.) og Institute of Computational Biology (C. T.-L.). Denne forskning blev også støttet af AMED under tilskudsnummer JP20jm0610035 (C.P.M.-J.). Vi takker Core Genomics på HMGU (I. de la Rosa) og Bioinformatics (T. Walzthoeni) støtte, især Xavier Pastor for uddannelse og vejledning. Vi takker A. Feuchtinger, U. Buchholz, J. Bushe og alle andre medarbejdere fra HMGU Pathology and Tissue Analytic core facility for deres tekniske og videnskabelige støtte samt J. Zorn, R. Erdelen, D. Würzinger, medarbejdere i E-Streifen samt Laboratory Animal Services kernefacilitet for deres løbende videnskabelige støtte og diskussion. Vi er taknemmelige for Core Facility Cell Analysis hos TranslaTUM (R. Mishra) og Luminex, A DiaSorin Company (P. Rein). Vi takker Dr. I Deligiannis for hans tekniske support. Dr. M. Hartman, Dr. A. Schröder og Ms. A. Barden (Helmholtz Pioneer Campus) var grundlæggende for deres juridiske, ledelsesmæssige og administrative støtte.
10% Tween 20 – 5 mL | Bio-Rad | 1662404 | |
2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
Adhesive PCR film | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis | Agilent | 5067-4626 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196 | |
Cell Sorter | For fluoresence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter. | ||
Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000619 | Use chilled at 4 °C |
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | 1000127 | |
Chromium Next GEM Chip J Single cell kit, 16 reactions | 10X Genomics | 1000230 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1, 4 reactions | 10X Genomics | 1000269 | |
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 reactions | 10X Genomics | 1000285 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 11873580001 | |
Dithiothreitol (DTT) 1 M solution | Sigma Aldrich | 646563 | Make 1 mM stock solution and use at 1 µM final concentration. |
DNA AWAY Surface Decontaminant | Thermo Fisher Scientific | 10223471 | Wipe surfaces and pipettes before start of experiment |
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 16628742 | |
DNA LoBind Tubes, 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 16638742 | |
Elution Buffer (EB) – 250 mL | Qiagen | 19086 | |
Eppendorf ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 13527550 | |
Eppendorf ThermoMixer C Accessory: Smartblock | Thermo Fisher Scientific | 13518470 | |
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade – 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 10517694 | |
Filters 50 µm, sterile | SYSMEX PARTEC – CELLTRICS | 04-004-2327 | Adjust filter diameter according with tissue and nuclei size |
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) – 1 L | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
Hard-Shell, 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white | Bio-Rad | HSP3905 | |
Herenz Heinz ABS Forceps | Thermo Fisher Scientific | 1131884 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water | Invitrogen | H3570 | Light-sensitive |
Imaging Flow Cytometer | For imaging flow cytometry analysis, e.g. Luminex Amnis ImageStream | ||
Invitrogen TE Buffer – 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 11568846 | |
KCl (2 M), RNase-free, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | AM9640G | |
MgCl2 (1 M), 100 mL | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
MicroAmp 8-Cap Strip, clear-300 strips | Thermo Fisher Scientific | 10209104 | |
MicroAmp 8-Tube Strip, 0.2 mL-125 strips | Thermo Fisher Scientific | 10733087 | |
Mörser 2 mL DOUNCE | Wagner & Munz GmbH | 9651632 | RNase zap and rinse with MillQ before use |
MyFuge 12 Mini MicroCentrifuge C1012 | Benchmark Scientific | C1012 | Or any other strip and tube mini centrifuge |
Neubauer Hemocytometer | OMNILAB LABORZENTRUM | 5435293 | Visualize and count nuclei under microscope |
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma Aldrich | D1556 | |
Pipette tips RT LTS 1000 µL, Wide-O | Mettler Toledo | 30389218 | |
Pistill "A" 2 mL | Wagner & Munz GmbH | 9651621 | RNase zap and rinse with MillQ before use |
Pistill "B" 2 mL | Wagner & Munz GmbH | 9651627 | RNase zap and rinse with MillQ before use |
Polypropylene 15 mL Centrifuge Tube | Thermo Fisher Scientific | 10579691 | |
Polystyrene Petri dish, 60 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 10634141 | |
Polystyrene Round-Bottom 5 mL FACS Tubes | Thermo Fisher Scientific | 10100151 | |
Protector RNase inhibitor – 2,000 U | Sigma Aldrich | 3335399001 | Keep in -20 °C until use |
Protein-based RNase Inhibitor SUPERase•In (20 U/μL) | Thermo Fisher Scientific | AM2696 | Keep in -20 °C until use |
Recombinant RNase Inhibitor | Clontech Takara | 2313B | Keep in -20 °C until use |
RNAse free microfuge tubes – 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | Wipe surfaces and pipettes before start of experiment |
SPRIselect – 60 mL | Beckman Coulter | B23318 | Aliquot and store in 4 °C |
Sucrose, 500 g | Sigma Aldrich | S0389-500G | Make a 1 M stock solution |
Swann-Morton Sterile Disposable Stainless Steel Scalpels | Thermo Fisher Scientific | 11798343 | |
Tris-HCI (1M), pH 8.0 | Invitrogen | 15568025 | |
Triton X-100, 98%, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 10671652 | Make 10% stock solution. Keep at 4 °C and protect from light. |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 11538886 | |
Vortex- Mixer | VWR | 444-1372 | Or any other type of vortex |