यहां, हम एकल-नाभिक आरएनए-सेक, एटीएसी-सेक और संयुक्त मल्टीओमिक्स (आरएनए-सेक और एटीएसी-सेक) के लिए फ्लैश-जमे हुए, संग्रहीत यकृत ऊतकों से नाभिक को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
यकृत एक जटिल और विषम ऊतक है जो कई महत्वपूर्ण शारीरिक कार्यों को पूरा करने के लिए जिम्मेदार है, जैसे कि ऊर्जा होमियोस्टेसिस का रखरखाव और ज़ेनोबायोटिक्स का चयापचय, दूसरों के बीच। ये कार्य यकृत पैरेन्काइमल और गैर-पैरेन्काइमल कोशिकाओं के बीच तंग समन्वय के माध्यम से किए जाते हैं। इसके अतिरिक्त, विभिन्न चयापचय गतिविधियां यकृत लोब्यूल के विशिष्ट क्षेत्रों तक ही सीमित हैं- एक घटना जिसे यकृत ज़ोनेशन कहा जाता है। एकल-कोशिका अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों में हालिया प्रगति ने शोधकर्ताओं को एकल-कोशिका संकल्प पर ऊतक विषमता की जांच करने के लिए सशक्त बनाया है। यकृत सहित कई जटिल ऊतकों में, कठोर एंजाइमैटिक और / या यांत्रिक पृथक्करण प्रोटोकॉल स्वास्थ्य और बीमारी में इस अंग को व्यापक रूप से चिह्नित करने के लिए आवश्यक एकल-कोशिका निलंबन की व्यवहार्यता या गुणवत्ता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकते हैं।
यह पेपर जमे हुए, संग्रहीत यकृत ऊतकों से नाभिक को अलग करने के लिए एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। यह विधि उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक उत्पन्न करती है जो डाउनस्ट्रीम, एकल-कोशिका ओमिक्स दृष्टिकोणों के साथ संगत होती है, जिसमें एकल-नाभिक आरएनए-सेक, उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (एटीएसी-सेक) के साथ ट्रांसपोसेज-सुलभ क्रोमैटिन के लिए परख, साथ ही मल्टीमॉडल ओमिक्स (संयुक्त आरएनए-सेक और एटीएसी-सेक) शामिल हैं। इस विधि का उपयोग स्वस्थ और रोगग्रस्त मानव, माउस और गैर-मानव प्राइमेट जमे हुए यकृत नमूनों से नाभिक के अलगाव के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। यह दृष्टिकोण यकृत में सभी प्रमुख सेल प्रकारों के निष्पक्ष अलगाव की अनुमति देता है और इसलिए, एकल-कोशिका संकल्प पर यकृत का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत पद्धति प्रदान करता है।
एकल-कोशिका जीनोमिक्स तेजी से यकृत समारोह का अध्ययन करने और स्वास्थ्य औररोग की स्थिति में सेलुलर विषमता के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक आवश्यक पद्धति बन रहा है। सूचना की विभिन्न परतों के एक साथ माप और मजबूत कम्प्यूटेशनल पाइपलाइनों के समानांतर विस्तार के लिए “मल्टीओमिक्स” का तेजी से विकास सामान्य और रोगग्रस्त यकृत2 में पहले से अज्ञात सेल प्रकारों और उपप्रकारों की खोज के लिए मार्ग प्रशस्त कर रहा है।
बायोबैंक और संग्रहीत जमे हुए नमूनों की खोज की संभावना ने गैर-पैरेन्काइमल कोशिकाओं 3,4,5 की भूमिका को फिर से देखने और खोजने और उम्र बढ़ने के दौरान और पुरानी बीमारियों में पॉलीप्लोइड हेपेटोसाइट्स की भूमिका की जांच करने के अवसरों में काफी वृद्धि की है। . इसलिए, यह पेपर फ्लैश-फ्रोजन (एफएफ) संग्रहीत लिवर के लिए एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एकल-नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो डाउनस्ट्रीम सिंगल-न्यूक्लियस आरएनए अनुक्रमण और एटीएसी अनुक्रमण के साथ-साथ मल्टीमॉडल ओमिक्स (संयुक्त आरएनए-सेक और एटीएसी-सेक) के साथ संगत है (चित्रा 1)।
यह वर्कफ़्लो एंजाइमेटिक पृथक्करण प्रोटोकॉल में सेल के आकार या नाजुकता से स्वतंत्र, यकृत में सभी सेल प्रकारों के ट्रांसस्क्रिप्टम और क्रोमैटिन पहुंच की जांच की अनुमति देता है। यह कीमती मानव नमूनों या ट्रांसजेनिक चूहों से छोटे ऊतक वर्गों (15-30 मिलीग्राम या 5-10 मिमी3) के साथ किया जा सकता है। नाभिक अलगाव की उच्च शुद्धता का निर्धारण करने में परमाणु आकार की मात्रा और माप शामिल है, जो बढ़े हुए सेल आकार और सेनेसेंस10,11 के साथ सहसंबंधित हो सकता है, और यह शुद्धता हेपेटोसाइट प्लोइडी 12 और सेल आकार-निर्भर ट्रांसक्रिप्शनल तंत्र 11,13,14,15 दोनों के विश्लेषण के लिए प्रासंगिक है। . इसके अतिरिक्त, जमे हुए यकृत से अलग नाभिक यकृत ज़ोनेशन के बारे में मूल्यवान जानकारी बनाए रखते हैं। वर्कफ़्लो और ऊतक संग्रह एकल-कोशिका जीनोमिक्स डेटा या आगे पूरक विश्लेषण, जैसे कि इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या एक ही ऊतक और एक ही व्यक्ति से स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स के सत्यापन की अनुमति देते हैं। इसलिए, इस दृष्टिकोण को कई यकृत रोग स्थितियों पर लागू किया जा सकता है और जीवों को व्यवस्थित और मज़बूती से मॉडल किया जा सकता है।
एकल-कोशिका या एकल-नाभिक आरएनए-सेक द्वारा यकृत की सेलुलर संरचना का विच्छेदन यकृत रोग के विकास और प्रगति 3,4,5,24 की गहरी समझ प्रदान करता है। यकृत से एकल-कोशिका अलगाव समय लेने वाला है और इसके लिए प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है जिसमें कठोर यांत्रिक या एंजाइमेटिक पृथक्करण25,26,27 शामिल होते हैं। यह व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है कि प्रत्येक ऊतक को इष्टतम ऊतक पृथक्करण प्रोटोकॉल निर्धारित करने के लिए एक व्यवस्थित मूल्यांकन की आवश्यकता होती है, साथ ही नाजुक सेल प्रकार या नाभिक28 को पकड़ने के लिए एक उपयुक्त भंडारण विधि भी होती है। ऊतक उपलब्धता, रुचि की बीमारी, विकास चरण, या मॉडल जीव के आधार पर, डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण के लिए एकल-नाभिक निलंबन की तैयारी एकल-कोशिका निलंबन का उपयोग करने की तुलना में अधिक उपयुक्त पद्धति हो सकती है। महत्वपूर्ण रूप से, यकृत में, एससीआरएनए-सेक और एसएनआरएनए-सेक ने परमाणु और साइटोप्लाज्मिक एमआरएनए के बीच एक उच्च सहसंबंध दिखाया है, यह सुझाव देते हुए कि दोनों दृष्टिकोण पूरक जानकारी 2,3,4,6,29 प्रस्तुत करते हैं।
यह पेपर मनुष्यों और मकाक सहित चूहों और अन्य प्रजातियों से जमे हुए, संग्रहीत यकृत नमूनों से एक मानकीकृत, मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एकल-नाभिक अलगाव प्रदान करता है। इस विधि का उपयोग चाउ और उच्च वसा वाले आहार (एचएफडी) के साथ खिलाए गए जंगली प्रकार के चूहों के लिए और अच्छी तरह से प्लेट-आधारित और बूंद-आधारित एकल-नाभिक जीनोमिक दृष्टिकोण दोनों का उपयोग करके यकृत फाइब्रोसिस के माउस मॉडलके लिए किया जा सकता है। यह विधि कृष्णास्वामी एट अल.30 द्वारा मस्तिष्क के ऊतकों के लिए मूल रूप से वर्णित प्रोटोकॉल पर निर्भर करती है, जिसमें फ्लैश-जमे हुए यकृत के अनुरूप अतिरिक्त संशोधन होते हैं। इष्टतम समरूपीकरण परमाणु झिल्ली अखंडता को नकारात्मक रूप से प्रभावित किए बिना ऊतक से अधिकांश नाभिक को मुक्त करता है। हालांकि, ओवरडॉंसिंग नाजुक नाभिक को नुकसान पहुंचा सकती है और उनकी समग्र गुणवत्ता को कम कर सकती है। युवा और / या फैटी लीवर को आमतौर पर मूसल ए के साथ केवल 5 स्ट्रोक और पेस्टल बी के साथ 10 स्ट्रोक की आवश्यकता होती है, जबकि पुराने और / या फाइब्रोटिक लिवर को मूसल बी के साथ 15 स्ट्रोक की आवश्यकता हो सकती है, लेकिन अधिक नहीं। इसलिए, यहां बताई गई संख्याओं से परे अधिक स्ट्रोक करने की सिफारिश नहीं की जाती है। ओवरडॉंसिंग एकल-नाभिक निलंबन की गुणवत्ता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकती है और परिवेश आरएनए की मात्रा में वृद्धि कर सकती है। इसके बाद, इससे डाउनस्ट्रीम डेटा विश्लेषण के दौरान अतिरिक्त कम्प्यूटेशनल फ़िल्टरिंग चरणों को करने की आवश्यकता हो सकती है।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल बहुमुखी है और युवा (3 महीने) और पुराने (24 महीने) चूहों में विभिन्न यकृत स्थितियों में समायोजित किया जा सकता है। चूंकि हमने पाया कि जिगर का एक बड़ा हिस्सा पुराने, एचएफडी और फाइब्रोटिक ऊतकों के लिए आवश्यक है, प्रसंस्करण के लिए उपलब्ध ऊतक का आकार कुछ उपयोगकर्ताओं के लिए जैविक सामग्री शुरू करने की छोटी मात्रा के साथ एक सीमा पैदा कर सकता है। हालांकि, बूंद-आधारित जीनोमिक परख के साथ तत्काल नमूना प्रसंस्करण के लिए ढाल शुद्धिकरण की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। यदि नाभिक को अच्छी तरह से आधारित परख के लिए 96-/384-वेल प्लेटों में एफएसीएस क्रमबद्ध करने की आवश्यकता होती है, तो ढाल शुद्धिकरण को छोड़ा जा सकता है। हम उपयोगकर्ताओं को अभी भी ढाल शुद्धिकरण करने के लिए प्रोत्साहित करते हैं यदि एफएसीएस सॉर्टिंग के लिए अनुशंसित नाभिक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पर्याप्त ऊतक नमूना है (यानी, ~ 1 × 105 नाभिक / एमएल)।
यकृत को हेपेटोसाइट्स9 की पॉलीप्लोइड प्रकृति की विशेषता है, लेकिन सामान्य शरीर विज्ञान और बीमारी में हेपेटोसाइट प्लोइडी की भूमिका अभी तक स्पष्ट नहीं है। सबूतों का एक बढ़ता हुआ शरीर है जो दर्शाता है कि प्लोइडी जीनोमिक परिवर्तनशीलता प्रदान करता है31, और यह अच्छी तरह से ज्ञात है कि32,33 वर्ष की आयु के साथ प्लोइडी बढ़ जाती है। मोनोन्यूक्लिएटेड टेट्राप्लोइड हेपेटोसाइट्स का संवर्धन, हालांकि, मानव हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) 34 में खराब रोग का निदान के साथ चिकित्सकीय रूप से जुड़ा हुआ है। इसी तरह, हेपेटोसाइट प्लोइडी के स्तर में परिवर्तन उम्र बढ़ने से संबंधित पुरानी यकृत रोगों जैसे गैर-मादक फैटी लिवर रोग (एनएएफएलडी) 35,36,37 से जुड़ा हुआ है। प्लोइडी जीनोम की दो से अधिक प्रतियां रखने की स्थिति है, जिसे होचस्ट38 जैसे डीएनए डाई के साथ जीनोम सामग्री को धुंधला करके पता लगाया जा सकता है। होचस्ट डाई, जिसे निष्कर्षण से पहले एचबी में जोड़ा जाता है, अलगाव प्रोटोकॉल के दौरान सभी नाभिकों को लेबल करता है। यह एक प्रवाह साइटोमेट्री उपकरण पर यूवी (350 एनएम) या वायलेट (450 एनएम) लेजर द्वारा उत्तेजित होने पर उनकी डीएनए सामग्री के आधार पर द्विगुणित और पॉलीप्लोइड नाभिक के बीच अंतर करने की अनुमति देता है। प्रदर्शित गेटिंग रणनीति के साथ, ऊतक समारोह1 (चित्रा 3 ए) में सेलुलर विषमता की भूमिका को बेहतर ढंग से समझने के लिए जमे हुए, संग्रहीत यकृत में हेपेटोसाइट प्लोइडी के 2 एन, 4 एन, 8 एन और उच्च स्तर की जांच की जा सकती है। इसके अलावा, आकार और मात्रा सहित परमाणु आकृति विज्ञान को इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है ताकि नाभिक के आकार में परिवर्तन को गुणित स्तर (चित्रा 3 बी, सी) के आधार पर गणना की कुल संख्या या जीन की संख्या में परिवर्तन के साथ सहसंबंधित किया जा सके।
मल्टीमॉडल ओमिक्स माप एक साथ जीनोमिक संगठन की कई परतों की जांच करने का अवसर प्रदान करता है। संयुक्त आरएनए + एटीएसी मल्टीओमिक्स दृष्टिकोण अपस्ट्रीम नियामकों और डाउनस्ट्रीम चयापचय जीन की जांच की अनुमति देता है, जो ट्रांसक्रिप्शनल नेटवर्क और एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर यकृत समारोह से जुड़े क्रोमैटिन आर्किटेक्चर का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण प्रदान करता है। इसके अलावा, कम्प्यूटेशनल विधियों में प्रगति के साथ जो डेटा स्पर्श और अनुक्रमण लागत में कमी के लिए जिम्मेदार हो सकते हैं, एकल-सेल मल्टीओमिक्स एक ही सेल से कई तौर-तरीकों के मूल्यांकन का नेतृत्व कर रहा है। यह एकल-नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल अभिव्यक्ति और क्रोमैटिन डेटा सेट के व्यक्तिगत और संयुक्त मूल्यांकन के साथ संगत है। हमने डेटा की गुणवत्ता को चित्रित करने के लिए स्टुअर्ट एट अल .23 (सिग्नैक पैकेज) द्वारा स्थापित मानक पाइपलाइनों का उपयोग किया है, जबकि डाउनस्ट्रीम विश्लेषण 23,39,40,41 के लिए कई उपलब्ध और वैकल्पिक कम्प्यूटेशनल विधियों को आसानी से अपनाया जा सकता है।
कुल मिलाकर, एकल-नाभिक मल्टीओमिक्स यहां प्रस्तुत नाभिक-निष्कर्षण प्रोटोकॉल को लागू करके बहुत कम मात्रा में प्रारंभिक नमूना सामग्री का उपयोग करके जैव-संग्रहीत, एफएफ माउस, मानव और गैर-मानव प्राइमेट यकृत ऊतकों की जांच की अनुमति देता है। यह अमूल्य उपकरण यकृत जीवविज्ञानियों को विभिन्न यकृत विकृति के संदर्भ में जीन अभिव्यक्ति और क्रोमैटिन पहुंच दोनों से पूछताछ करने के लिए सशक्त करेगा। इसके अतिरिक्त, हेपेटोसाइट प्लोइडी के विभिन्न स्तर और यकृत लोब्यूल में उनके स्थान पर निर्भर जीन अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप समायोजन यकृत विकृति में उनकी भूमिका को प्रकट कर सकता है। इसलिए, हम अनुमान लगाते हैं कि सेलुलर विषमता की जांच एचसीसी और एनएएफएलडी जैसी बीमारियों के खिलाफ सटीक चिकित्सा और लक्षित हस्तक्षेप के विकास के लिए नए अवसर प्रदान करेगी।
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को हेल्महोल्ट्ज़ पायनियर कैंपस (एमएस, केवाई, सीपीएम-जे) और इंस्टीट्यूट ऑफ कम्प्यूटेशनल बायोलॉजी (सीटी-एल) द्वारा समर्थित किया गया था। इस शोध को अनुदान संख्या जेपी 20जेएम0610035 (सी.पी.एम.-जे.) के तहत एएमईडी द्वारा भी समर्थित किया गया था। हम एचएमजीयू (आई डे ला रोजा) और जैव सूचना विज्ञान (टी वाल्ज़थोनी) समर्थन में कोर जीनोमिक्स को धन्यवाद देते हैं, विशेष रूप से जेवियर पास्टर को प्रशिक्षण और मार्गदर्शन के लिए। हम एचएमजीयू पैथोलॉजी और ऊतक विश्लेषणात्मक कोर सुविधा के ए. फ्यूचिंगर, यू. बुचोल्ज़, जे. बुश और अन्य सभी स्टाफ सदस्यों को उनके तकनीकी और वैज्ञानिक समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं, साथ ही, जे ज़ोर्न, आर एर्डेलन, डी वुर्जिंगर, ई-स्ट्रेफेन के स्टाफ सदस्यों के साथ-साथ प्रयोगशाला पशु सेवा कोर सुविधा को उनके चल रहे वैज्ञानिक समर्थन और चर्चा के लिए धन्यवाद देते हैं। हम ट्रांसलैटम (आर मिश्रा) और ल्यूमिनेक्स, ए डायसोरिन कंपनी (पी रेन) में कोर फैसिलिटी सेल विश्लेषण के आभारी हैं। हम अपने तकनीकी समर्थन के लिए डॉ आई डेलिगियानिस को धन्यवाद देते हैं। हार्टमैन, डॉ ए श्रोडर और सुश्री ए बार्डेन (हेल्महोल्ट्ज़ पायनियर कैंपस) अपने कानूनी, प्रबंधकीय और प्रशासनिक समर्थन के लिए मौलिक थे।
10% Tween 20 – 5 mL | Bio-Rad | 1662404 | |
2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
Adhesive PCR film | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis | Agilent | 5067-4626 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196 | |
Cell Sorter | For fluoresence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter. | ||
Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000619 | Use chilled at 4 °C |
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | 1000127 | |
Chromium Next GEM Chip J Single cell kit, 16 reactions | 10X Genomics | 1000230 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1, 4 reactions | 10X Genomics | 1000269 | |
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 reactions | 10X Genomics | 1000285 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 11873580001 | |
Dithiothreitol (DTT) 1 M solution | Sigma Aldrich | 646563 | Make 1 mM stock solution and use at 1 µM final concentration. |
DNA AWAY Surface Decontaminant | Thermo Fisher Scientific | 10223471 | Wipe surfaces and pipettes before start of experiment |
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 16628742 | |
DNA LoBind Tubes, 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 16638742 | |
Elution Buffer (EB) – 250 mL | Qiagen | 19086 | |
Eppendorf ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 13527550 | |
Eppendorf ThermoMixer C Accessory: Smartblock | Thermo Fisher Scientific | 13518470 | |
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade – 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 10517694 | |
Filters 50 µm, sterile | SYSMEX PARTEC – CELLTRICS | 04-004-2327 | Adjust filter diameter according with tissue and nuclei size |
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) – 1 L | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
Hard-Shell, 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white | Bio-Rad | HSP3905 | |
Herenz Heinz ABS Forceps | Thermo Fisher Scientific | 1131884 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water | Invitrogen | H3570 | Light-sensitive |
Imaging Flow Cytometer | For imaging flow cytometry analysis, e.g. Luminex Amnis ImageStream | ||
Invitrogen TE Buffer – 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 11568846 | |
KCl (2 M), RNase-free, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | AM9640G | |
MgCl2 (1 M), 100 mL | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
MicroAmp 8-Cap Strip, clear-300 strips | Thermo Fisher Scientific | 10209104 | |
MicroAmp 8-Tube Strip, 0.2 mL-125 strips | Thermo Fisher Scientific | 10733087 | |
Mörser 2 mL DOUNCE | Wagner & Munz GmbH | 9651632 | RNase zap and rinse with MillQ before use |
MyFuge 12 Mini MicroCentrifuge C1012 | Benchmark Scientific | C1012 | Or any other strip and tube mini centrifuge |
Neubauer Hemocytometer | OMNILAB LABORZENTRUM | 5435293 | Visualize and count nuclei under microscope |
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma Aldrich | D1556 | |
Pipette tips RT LTS 1000 µL, Wide-O | Mettler Toledo | 30389218 | |
Pistill "A" 2 mL | Wagner & Munz GmbH | 9651621 | RNase zap and rinse with MillQ before use |
Pistill "B" 2 mL | Wagner & Munz GmbH | 9651627 | RNase zap and rinse with MillQ before use |
Polypropylene 15 mL Centrifuge Tube | Thermo Fisher Scientific | 10579691 | |
Polystyrene Petri dish, 60 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 10634141 | |
Polystyrene Round-Bottom 5 mL FACS Tubes | Thermo Fisher Scientific | 10100151 | |
Protector RNase inhibitor – 2,000 U | Sigma Aldrich | 3335399001 | Keep in -20 °C until use |
Protein-based RNase Inhibitor SUPERase•In (20 U/μL) | Thermo Fisher Scientific | AM2696 | Keep in -20 °C until use |
Recombinant RNase Inhibitor | Clontech Takara | 2313B | Keep in -20 °C until use |
RNAse free microfuge tubes – 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | Wipe surfaces and pipettes before start of experiment |
SPRIselect – 60 mL | Beckman Coulter | B23318 | Aliquot and store in 4 °C |
Sucrose, 500 g | Sigma Aldrich | S0389-500G | Make a 1 M stock solution |
Swann-Morton Sterile Disposable Stainless Steel Scalpels | Thermo Fisher Scientific | 11798343 | |
Tris-HCI (1M), pH 8.0 | Invitrogen | 15568025 | |
Triton X-100, 98%, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 10671652 | Make 10% stock solution. Keep at 4 °C and protect from light. |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 11538886 | |
Vortex- Mixer | VWR | 444-1372 | Or any other type of vortex |