Visualisere tidlige infeksjonssteder av risblastsykdom (Magnaporthe oryzae) på bygg (Hordeum vulgare) ved hjelp av et grunnleggende mikroskop og en smarttelefon

Summary

Dette er en enkel protokoll for en byggbladskjedeanalyse ved bruk av minimale reagenser og vanlig laboratorieutstyr (inkludert en grunnleggende smarttelefon). Hensikten er å visualisere den tidlige infeksjonsprosessen av blastsykdom i laboratorier uten tilgang til avansert mikroskopiutstyr.

Abstract

Å forstå hvordan planter og patogener samhandler, og om samspillet kulminerer i forsvar eller sykdom, er nødvendig for å utvikle sterkere og mer bærekraftige strategier for plantes helse. Fremskritt i metoder som mer effektivt avbilder plantepatogenprøver under infeksjon og kolonisering, har gitt verktøy som risbladskjedeanalysen, som har vært nyttig for å overvåke infeksjon og tidlige koloniseringshendelser mellom ris og sopppatogenet, Magnaporthe oryzae. Dette hemi-biotrofiske patogenet forårsaker alvorlig sykdomstap i ris og relaterte monocoter, inkludert hirse, rug, bygg og mer nylig, hvete. Bladkappeanalysen, når den utføres riktig, gir en optisk klar planteseksjon, flere lag tykk, noe som gjør det mulig for forskere å utføre levende celleavbildning under patogenangrep eller generere faste prøver farget for spesifikke funksjoner. Detaljerte cellulære undersøkelser av bygg-M. oryzae-interaksjonen har ligget bak risvertens, til tross for den økende betydningen av dette kornet som matkilde for dyr og mennesker og som gjærede drikker. Rapportert her er utviklingen av en byggbladskjedeanalyse for intrikate studier av M. oryzae-interaksjoner i løpet av de første 48 timene etter inokulering. Bladkappeanalysen, uavhengig av hvilken art som studeres, er delikat; Forutsatt er en protokoll som dekker alt, fra byggvekstforhold og oppnåelse av en bladkappe, til inokulering, inkubasjon og avbildning av patogenet på planteblader. Denne protokollen kan optimaliseres for screening med høy gjennomstrømning ved hjelp av noe så enkelt som en smarttelefon for bildebehandling.

Introduction

Magnaporthe oryzae, risblåsoppen, infiserer et utvalg kornavlinger, inkludert bygg, hvete og ris¹. Dette patogenet forårsaker ødeleggende sykdommer og utgjør en verdensomspennende trussel mot disse verdifulle avlingene, og forårsaker fullstendig avlingstap hvis det ikke kontrolleres. Mange laboratorier rundt om i verden fokuserer på risblastsykdom på grunn av sin globale trussel og dens egenskaper som en utmerket modell for plante-sopp-interaksjoner². Det har blitt fullstendig sekvensert, og genetikken til dens infeksjonssyklus, spesielt de tidlige hendelsene, er etablert ^3,4. Livssyklusen begynner med en spore som spirer på en bladoverflate, og danner den spesialiserte penetrasjonsstrukturen kalt appressorium. Appressorium trenger inn i bladvevet, og infeksjonen fortsetter med utviklingen av lesjoner som starter prosessen med sporulering og spredning av sykdom⁴. Forhindre noen av disse tidlige hendelsene ville drastisk hemme denne ødeleggende sykdommen. Følgelig har den nyeste forskningen på blastsykdom vært fokusert på de tidlige infeksjonstrinnene, fra de spirede konidiene som danner et appressorium til utviklingen av invasive hyfer og det biotrofiske grenseflatekomplekset (BIC)⁵.

Den enorme mengden forskning på blastsykdom har blitt utført i ris, selv om M. oryzae er et betydelig patogen for en rekke avlinger, og nyutviklede stammer dukker opp som en global trussel mot hvete⁶. Mens ris er en av de tre viktigste stiftavlingene som brukes til å mate befolkningen, sammen med hvete og mais, er bygg det fjerde kornkornet når det gjelder husdyrfoder og ølproduksjon⁷. Etter hvert som håndverksølindustrien vokser, øker også den økonomiske verdien av bygg. Det er klare fordeler ved å bruke M. oryzae og bygg som et patosystem for å studere blastsykdom. For det første er det stammer av M. oryzae som bare smitter bygg, samt stammer som kan infisere flere gressarter. For eksempel smitter 4091-5-8 primært bare bygg, mens Guy11 og 70-15 kan infisere både bygg og ris⁸. Disse stammene er genetisk like, og infeksjonsprosessen er sammenlignbar⁹. For det andre, under standard laboratorie- og drivhusforhold, er bygg lettere å dyrke, da det ikke har de kompliserte kravene til ris (kortfattet temperaturkontroll, høy luftfuktighet, spesifikke lysspektra). Det er også bildemessige utfordringer med ris på grunn av hydrofobisiteten til bladoverflaten, som bygg ikke viser¹⁰.

Denne protokollen presenterer en enkel metode for å isolere og effektivt utnytte byggbladskjede for mikroskopisk analyse av flere infeksjonsstadier, ved hjelp av vanlige laboratorieforsyninger og en smarttelefon for datainnsamling. Denne metoden for byggbladskjedeanalysen er tilpasningsdyktig for laboratorier over hele verden, da det krever minimale forsyninger, og gir likevel et klart bilde av den mikroskopiske interaksjonen mellom patogenet og de første cellene det infiserer. Mens patogenisitetsanalyser, for eksempel en spray eller dråpeinokulering, kan gi et makrosyn på patogenets evne til å danne lesjoner, tillater denne analysen forskeren å visualisere spesifikke trinn med tidlig infeksjon, fra pre-penetrasjonshendelser til kolonisering av epidermale celler. Videre kan forskere enkelt sammenligne infeksjon med villtype sopp til infeksjon med en mutant redusert i virulens.

Protocol

1. Fremstilling av eksperimentelle materialer Forbered havregrynagar (OMA) ved å blande havregryn til det er et fint pulver. Tilsett 25 g havregrynpulver og 15 g agar til 500 ml ddH2O, og autoklav på mediesyklus (alternativt kokes det i 20 minutter). Hell mediet i sterile 60 mm petriskåler.MERK: Andre medietyper som induserer sporulering, for eksempel V8-agar, er akseptable for denne protokollen. Plate M. oryzae filtrerer skjefter direkte på OMA-platene ved…

Representative Results

En skildring av den opprinnelige arbeidsflyten for denne teknikken er vist i figur 1. Slirene ble høstet fra 14 dager gamle mottakelige “Lacey” byggplanter (H. vulgare). Conidiene ble høstet fra 10 dager gamle sporulerende M. oryzae OMA-plater, med en conidial suspensjon fremstilt ved bruk av steril ddH2O for en endelig konsentrasjon på 5 x 104 sporer per ml. Inokulumsuspensjonen ble direkte påført bladkappene, som ble festet til sterile petriskla…

Discussion

Det er mange ofte brukte analyser tilgjengelig for å teste M. oryzae-stammer som gir et makroskopisk nivå visuelt av en kompatibel eller inkompatibel infeksjonsrespons, for eksempel spray- eller dråpeinokulasjoner, og bruk av vurderingssystemer for å kvantifisere lesjonsstørrelser^13,14. En annen vanlig analyse for M. oryzae er å teste patogenes evne til å danne sin spesialiserte penetrasjonsstruktur, apppressorium^15</sup…

Materials

Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Cell phone	Google	Pixel 4A	Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice.
Cell phone Microscope adapter	Vankey	B01788LT3S	https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Microscope	AmScope	FM690TC	40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope
Oatmeal old fashioned rolled oats	Quaker	N/A	https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1
ProMix BX	ProMix	1038500RG
Rectangular coverglass	Corning	CLS2975245
Slides, microscope	Sigma-Aldrich	S8902
Stage micrometer	OMAX	A36CALM7	0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide
Trypan blue	Sigma-Aldrich	T6146