Análisis de expresión génica en folículos humanos
Summary
Aquí, describimos un protocolo que describe cómo aislar los folículos ováricos humanos del tejido cortical congelado-descongelado para realizar análisis de expresión génica.
Abstract
El ovario es un órgano heterogéneo compuesto por diferentes tipos de células. Para estudiar los mecanismos moleculares que ocurren durante la foliculogénesis, la localización de proteínas y la expresión génica se pueden realizar en tejido fijo. Sin embargo, para evaluar adecuadamente los niveles de expresión génica en un folículo humano, esta estructura compleja y delicada debe aislarse. Por lo tanto, se ha desarrollado un protocolo adaptado previamente descrito por el laboratorio de Woodruff para separar los folículos (el ovocito y las células de la granulosa) de su entorno circundante. El tejido cortical ovárico se procesa primero manualmente para obtener pequeños fragmentos utilizando dos herramientas: una cortadora de tejidos y una cortadora de tejidos. Luego, el tejido se digiere enzimáticamente con 0,2% de colagenasa y 0,02% de DNasa durante al menos 40 minutos. Esta etapa de digestión se realiza a 37 °C y 5% deCO2 y se acompaña de pipeteo mecánico del medio cada 10 min. Después de la incubación, los folículos aislados se recogen manualmente utilizando una pipeta microcapilar calibrada bajo aumento al microscopio. Si los folículos todavía están presentes en las piezas de tejido, el procedimiento se completa con microdisección manual. Los folículos se recogen en hielo en un medio de cultivo y se enjuagan dos veces en gotitas de solución salina tamponada con fosfato. Este procedimiento de digestión debe controlarse cuidadosamente para evitar el deterioro del folículo. Tan pronto como la estructura de los folículos parece estar comprometida o después de un máximo de 90 minutos, la reacción se detiene con una solución bloqueadora de 4 °C que contiene un 10% de suero bovino fetal. Se debe recolectar un mínimo de 20 folículos aislados (con un tamaño inferior a 75 μm) para obtener una cantidad adecuada de ARN total después de la extracción de ARN para la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). Después de la extracción, la cuantificación del ARN total de 20 folículos alcanza un valor medio de 5 ng / μL. El ARN total se transcribe en ADNc, y los genes de interés se analizan más a fondo utilizando RT-qPCR.
Introduction
El ovario es un órgano complejo compuesto de unidades funcionales y estructurales, incluidos los folículos dentro de la corteza y el estroma. La foliculogénesis, el proceso de activación, crecimiento y maduración del folículo desde un estado quiescente primordial hasta un folículo maduro capaz de ser fertilizado y apoyar el desarrollo embrionario temprano, se estudia ampliamente en la investigación1. Desentrañar los mecanismos que impulsan este fenómeno podría mejorar la atención de la fertilidad para las mujeres2. Los análisis en tejido humano fijo permiten evaluar la expresión proteica y la localización génica dentro de las unidades funcionales del ovario 3,4. Sin embargo, se necesitan técnicas específicas para disociar los folículos de la corteza circundante para evaluar con precisión los niveles de expresión génica dentro de los folículos ováricos. Así, en un estudio previo, se desarrolló una técnica de aislamiento de folículos para permitir análisis de expresión génica directamente desde la unidad funcional del ovario5. Se han desarrollado diferentes enfoques, como la digestión enzimática y/o el aislamiento mecánico, así como la microdisección por captura láser, que permiten el aislamiento del folículo dentro de un pedazo de tejido 6,7,8,9. El aislamiento folicular es ampliamente utilizado, ya sea con tejido ovárico humano o animal, para evaluar los perfiles de expresión génica de los folículos en todas las etapas de desarrollo10,11,12. Sin embargo, un procedimiento de aislamiento óptimo debe tener en cuenta la frágil estructura del folículo dentro de la corteza densa y, por lo tanto, debe realizarse con cuidado para evitar cualquier daño7. Este manuscrito describe un procedimiento, adaptado de un protocolo descrito por el laboratorio de Woodruff, para aislar folículos humanos de la corteza ovárica congelada-descongelada con el fin de realizar análisis de expresión génica13.
El primer paso del aislamiento del folículo ovárico del tejido humano congelado es el procedimiento de descongelación. Este proceso se realiza con base en el protocolo clínico utilizado para el injerto de tejido ovárico criopreservado, como se describió anteriormente14,15. El proceso tiene como objetivo eliminar los agentes crioprotectores enjuagando la corteza ovárica en concentraciones decrecientes del medio. Luego, el tejido se fragmenta antes del aislamiento enzimático y mecánico para recuperar los folículos. Los folículos en diferentes etapas se pueden distinguir utilizando un microscopio estereoscópico con alto aumento y óptica de buena calidad para aislar los de interés. Cada folículo aislado se mide utilizando una regla integrada en el microscopio, y los folículos se pueden agrupar de acuerdo con su etapa de desarrollo: folículos primordiales (30 μm), folículos primarios (60 μm), folículos secundarios (120-200 μm) y folículos antrales (>200 μm)16. Se puede realizar una clasificación adicional de acuerdo con la morfología de los folículos: los folículos primordiales tienen una capa de células de la granulosa aplanada (GC), los folículos primarios tienen una capa de GC cuboidales, los folículos secundarios tienen al menos dos capas de GC cuboidales, y la presencia de una cavidad entre los GC caracteriza la etapa antral. Cuando se seleccionan folículos de interés, se realiza la extracción de ARN. La cantidad y la calidad del ARN se evalúan antes de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
La criopreservación del tejido ovárico es un enfoque prometedor para preservar la fertilidad de los pacientes con cáncer. En la clínica, el tejido cortical descongelado es injertado de nuevo en la paciente después de la remisión, permitiendo la reanudación de la función ovárica y la fertilidad19,20. Además del uso clínico, los fragmentos ováricos residuales también pueden ser donados para la investigación al final del período de almacenamiento para…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención de Excelencia de la Ciencia (EOS) (ID: 30443682). I.D. es investigador asociado en Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).
Materials
| 2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
| 4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
| Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
| Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| Transferrin | Roche | 10652202001 |
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