Method Article

Differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane in gruppi di isole produttrici di insulina

DOI:

10.3791/64840

⸱

June 23rd, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular & Physiological Sciences, Life Science Institute, University of British Columbia, 2School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 3STEMCELL Technologies Inc, 4Department of Surgery, University of British Columbia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La differenziazione delle cellule staminali in cellule insulari fornisce una soluzione alternativa al trattamento convenzionale del diabete e alla modellizzazione della malattia. Descriviamo un protocollo dettagliato di coltura di cellule staminali che combina un kit di differenziazione commerciale con un metodo precedentemente convalidato per aiutare a produrre isole derivate da cellule staminali secernenti insulina in un piatto.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in cellule beta secernenti insulina fornisce materiale per studiare la funzione delle cellule beta e il trattamento del diabete. Tuttavia, permangono sfide nell'ottenere cellule beta derivate da cellule staminali che imitano adeguatamente le cellule beta umane native. Sulla base di studi precedenti, sono state generate cellule insulari derivate da hPSC per creare un protocollo con risultati di differenziazione e coerenza migliorati. Il protocollo qui descritto utilizza un kit di progenitori pancreatici durante le fasi 1-4, seguito da un protocollo modificato da un articolo precedentemente pubblicato nel 2014 (denominato "protocollo R" di seguito) durante le fasi 5-7. Sono incluse procedure dettagliate per l'utilizzo del kit di progenitori pancreatici e piastre a micropozzetti da 400 μm di diametro per generare cluster di progenitori pancreatici, protocollo R per il differenziamento endocrino in un formato di sospensione statica a 96 pozzetti e caratterizzazione in vitro e valutazione funzionale di isole derivate da hPSC. Il protocollo completo richiede 1 settimana per l'espansione iniziale delle hPSC, seguita da ~5 settimane per ottenere le isole hPSC produttrici di insulina. Il personale con tecniche di coltura di base di cellule staminali e formazione in saggi biologici può riprodurre questo protocollo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule beta pancreatiche secernono insulina rispondendo all'aumento dei livelli di glucosio nel sangue. I pazienti che non hanno una produzione sufficiente di insulina a causa della distruzione autoimmune delle cellule beta nel diabete di tipo 1 (T1D)1, o a causa della disfunzione delle cellule beta nel diabete di tipo 2 (T2D)2, sono in genere trattati con la somministrazione di insulina esogena. Nonostante questa terapia salvavita, non può eguagliare con precisione lo squisito controllo della glicemia ottenuto dalla secrezione dinamica di insulina dalle cellule beta in buona fede. Pertanto, i pazienti spesso subisco....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo si basa sul lavoro con linee hPSC, tra cui H1, HUES4 PDXeG e Mel1 INSGFP/W, in condizioni di alimentazione libera. Una procedura passo-passo è descritta in dettaglio in questa sezione, con i dati di supporto della differenziazione di Mel1 INSGFP/W nella sezione dei risultati rappresentativi. Si consiglia di eseguire un'ulteriore ottimizzazione quando si lavora con altre linee hPSC non indicate qui. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i reagenti e le soluzioni utilizzate in questo protocollo.

1. Preparazione dei mezzi e delle soluzioni di differenziazi....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbiamo sviluppato una strategia ibrida per differenziare le cellule staminali in isole hPSC secernenti insulina in sette fasi, che utilizza un kit di progenitori pancreatici per i primi quattro stadi in coltura planare, seguito da un protocollo modificato basato su un metodo6 precedentemente riportato in una coltura in sospensione statica per gli ultimi tre stadi (Figura 1). Con questo protocollo, garantire una coltura vicina alla confluenza (90%-100%) a 24 ore dalla.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo documento descrive un protocollo ibrido a sette stadi che consente la generazione di isole hPSC in grado di secernere insulina in seguito a provocazione del glucosio entro 40 giorni dalla coltura in vitro. Tra queste molteplici fasi, si ritiene che l'induzione efficiente dell'endoderma definitivo costituisca un importante punto di partenza per gli esiti finali della differenziazione18,27,28. Nel protocollo del pr.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Timothy J. Kieffer era un dipendente di ViaCyte durante la preparazione di questo manoscritto. Gli altri autori dichiarano di non avere interessi contrastanti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Riconosciamo con gratitudine il supporto di STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF e Canadian Institutes of Health Research. Jia Zhao e Shenghui Liang hanno ricevuto il Michael Smith Health Research BC Trainee Award. Mitchell J.S. Braam ha ricevuto la borsa di studio Mitacs Accelerate. Diepiriye G. Iworima ha ricevuto la borsa di studio Alexander Graham Bell Canada Graduate e il CFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Award. Ringraziamo sinceramente il Dr. Edouard G. Stanley dell'MCRI e della Monash University per aver condiviso la linea Mel1 INS GFP/W e l'Alberta Diabetes Institute Islet Core per l'isolamento e....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3,3',5-Triiodo-L-tironina (T3)SigmaT6397Ormone tiroideo
4% soluzione di PFASanta Cruz Biotechnologysc-281692Deve essere maneggiato in cappa aspirante
a 96 pozzetti, attacco ultrabasso, fondo piattoCorning Costar (VWR)CLS3474Fondo piatto; per la coltura in sospensione statica nelle ultime tre fasi
AccutaseSTEMCELL Technologies07920Reagente di dissociazione per cellule di stadio 4
Piastre Aggrewell400STEMCELL Technologies34415400 µ piastre per micropozzetti di diametro m
piastre Aggrewell800 STEMCELLTechnologies34815800 µ piastre per micropozzetti di diametro m
Alexa Fluor 488 Capra anti-Umano FOXA2 (capra IgG)R& D SystemsIC2400G1:100 in citometria a flusso; utilizzato per il dosaggio di cellule di stadio 1
Alexa Fluor 488 Controllo dell'isotipo IgG di capraR& D SystemsIC108G1:100 in citometria a flusso
Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (topo IgG2B)BD Sciences5660321:250 in citometria a flusso; utilizzato per il dosaggio di cellule allo stadio 7
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype ControlR& D SystemsIC0041G1:500 in citometria a flusso
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (topo IgG1κ)BD Pharmingen5658311:2.000 in citometria a flusso; utilizzato per il dosaggio di cellule allo stadio 7
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (IgG1κ) di topoBD Sciences5656891:2.000 in citometria a flusso
Alexa Fluor 647 Topo anti-umano NKX6.1 (topo IgG1κ)BD Sciences5633381:33 in citometria a flusso; utilizzato per il saggio di cellule allo stadio 4
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (IgG1κ) di topoBD Sciences5625941:50 in citometria a flusso; utilizzato per il dosaggio di cellule di stadio 1
Alexa Fluor 647 IgG1 di topoκ Controllo isotipicoBD Sciences5577141:50 in citometria a flusso
ALK5i IICayman Chemicals14794Inibitore della segnalazione TGF-beta
Soluzione di risciacquo antiaderente STEMCELL Technologies7010soluzione di risciacquo per micropozzetti
CellvisD35-10-1-NPer GSIS statico e imaging confocale
Albumina sierica bovina (BSA)Thermo Fisher ScientificBP1600-100Per la procedura di immunocolorazione
Anticorpo CK19DAKOM08881:50 in immunofluorescenza a montatura intera
D-glucosioSigmaG8769Integratore medio
DAPISigmaD9542Per controcolorazione nucleare
DMEM/F12, HEPESThermo Fisher Scientific11330032Matrix soluzione diluente
Donkey anti-capra Alexa Fluor 555Life technologiesA214321:500 in immunofluorescenza a montatura intera
Donkey anti-goat Alexa Fluor 647Life technologiesA214471:500 in immunofluorescenza a montatura intera
Asino anti-topo Alexa Fluor 555Life technologiesA315701:500 in immunofluorescenza a montatura intera
Asino anti-topo Alexa Fluor 647Life technologiesA315711:500 in immunofluorescenza a montatura intera
Asino anti-coniglio Alexa Fluor 555Life technologiesA315721:500 in immunofluorescenza a montatura intera
Asino anti-coniglio Alexa Fluor 647Life technologiesA315731:500 in immunofluorescenza a montatura intera
Asino anti-pecora Alexa Fluor 647Life technologiesA214481:500 in immunofluorescenza a montatura intera
DPBSSigmaD8537Senza Ca2+ e Mg2+
ELISA, insulina, umanoAlpco80-INSHU-E01.1Per la misurazione dell'insulina umana
Proliant68700senza acidi grassiIntegratore medio
Kit di soluzioni per la fissazione e la permeabilizzazioneBD Sciences554714Fix/Perm e 10x Perm/Wash incluse
Reagente per dissociazione cellulare delicataSTEMCELL Technologies7174Per il passaggio di grumi di hPSC durante la coltura di mantenimento
Anticorpo glucagoneSigmaG26541:400 in immunofluorescenza a montatura intera
Anticorpo GLUT1Thermo Fisher ScientificPA1-377821:200 in immunofluorescenza a montatura intera
GlutaMAX-I (100x)Gibco35050061integratore di L-glutammina
GlycerolThermo Fisher ScientificG33-4Per la pulizia e il montaggio dei tessuti
GSi XXSigma Millipore565789Inibitore di Notch
EparinaSigmaH3149Integratore medio
ITS-X (100x)Thermo Fisher Scientific51500056Insulin-Transferrina-Selenio-Etanolammina; integratore medio
LDN193189 STEMCELL Technologies72147Antagonista BMP
Anticorpo MAFAAbcamab264051:200 in immunofluorescenza a montatura intera
Matrigel, qualificato hESCThermo Fisher Scientific08-774-552Matrice extracellulare per il rivestimento superficiale dei vasi
MCDB131 mediumLife technologies10372019Base medium
completo per terreni mTeSR1STEMCELL Tecnologie85850terreno di cellule staminali e 5x integratore incluso
N-Cys (N-acetil cisteina)SigmaA9165antiossidante
NaHCO3SigmaS6297Integratore medio
NEUROD1 anticorpoR & D SystemsAF27461:20 in immunofluorescenza a montatura intera
NKX6.1 anticorpoDSHBF55A12-c1:50 in immunofluorescenza a montatura
intera Anticorpo polipeptide pancreaticoR& D SystemsAF62971:200 in immunofluorescenza a montatura intera
PBSSigmaD8662Con Ca2+ e anticorpo Mg2+
PDX1Abcamab472671:200 in immunofluorescenza a montatura intera
PE Topo anti-umano GCG (topo IgG1κ)BD Sciences5658601:2.000 in citometria a flusso; utilizzato per il dosaggio di cellule di stadio 7
PE Topo anti-umano NKX6.1 (IgG1k di topo)BD Sciences5630231:250 in citometria a flusso
PE Topo anti-umano PDX1 (IgG1k di topo)BD Sciences5621611:200 in citometria a flusso; utilizzato per il dosaggio di cellule di stadio 4
PE IgG1 di topoκ Controllo dell'isotipoBD Sciences5546801:2.000 in citometria a flusso
PE Cromogranina A topo-umana (CHGA, IgG1k di topo)BD Sciences5645631:200 in citometria a flusso
R428 Cayman Chemicals21523AXL inibitore della tirosin-chinasi
Acido retinoide, all-transSigmaR2625
Tampone di lisi RIPA fotosensibile, 10xSigma20-188Per l'estrazione ormonale
SANT-1SigmaS4572SHH inibitore
SLC18A1 anticorpoSigmaHPA0637971:200 in immunofluorescenza a montatura intera
Anticorpo somatostatinaSigmaHPA0194721:100 in immunofluorescenza a montatura intera
STEMdiff Kit progenitore pancreatico STEMCELLTechnologies05120Terreni basali e integratori inclusi
Anticorpo sinaptofisinaNovusNB120-166591:25 in immunofluorescenza a montatura intera
Triton X-100SigmaX100Per la permeabilizzazione
Trolox Sigma Millipore648471analogo della vitamina E
TrypLE Enzyme ExpressLife tecnologie12604-021reagente enzimatico per il passaggio di singole cellule hPSC
Anticorpo Trypsin1/2/3R& D SystemsAF35861:25 in immunofluorescenza a montatura intera
Y-27632STEMCELL Technologies72304Inibitore ROCK
Solfato di zincoSigmaZ0251Integratore medio
Camera di saggio della BSA Kit

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
  2. Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
  3. Shapiro, A. M., et al.

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Human Pluripotent Stem CellsInsulin Producing Islet ClustersBeta Cell DifferentiationPancreatic Progenitor ClustersStatic Suspension CultureEndocrine DifferentiationGlucose Stimulated Insulin SecretionIslet Cell TypesPDX1 ExpressionNKX6 1 Expression

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